[發明專利]花曲柳懸浮培養體系的建立方法

無效

• 申請號: 201310111904.7
• 申請日: 2013-04-02
• 公開（公告）號: CN104094840A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 詹亞光;劉孚婧;齊鳳慧;尹靜;曾凡鎖;范桂枝
• 申請（專利權）人: 東北林業大學;詹亞光;劉孚婧
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一種利用基本培養基和附加激素建立花曲柳懸浮培養體系的方法，本發明隸屬植物細胞工程的技術領域。

背景技術

花曲柳(Fraxinus?rhynchophylla?Hance.)屬于木犀科梣屬落葉大喬木，又稱大葉白蠟、苦櫪白蠟樹。干燥樹皮、枝皮為我國的傳統中藥材“秦皮”的四種入藥皮料之一，具有清熱燥濕、明目和止咳平喘的作用。近年來的分析化學研究表明，其樹皮中含有多種香豆素類成分，如秦皮甲素(Esculin)，秦皮乙素(Esculetin)，秦皮苷(Fraxin)，秦皮素(Fraxetol)等。花曲柳干燥枝皮、干皮具有清熱燥濕，明目，收澀的功效。現代藥理學研究表明，其皮兼有抗菌、消炎、利尿、止咳平喘、鎮靜、祛痰等作用。近年來，有學者研究發現，香豆素類成分具有抗腫瘤、抗HIV以及免疫調節的重要作用。這使得香豆素類物質的價值越來越多地得以體現。目前常用藥用香豆素類化合物主要來自于木犀科白蠟屬植物，在入藥的秦皮來源中，花曲柳樹皮的香豆素總量含量最多。這使得白蠟屬樹木資源遭到了破壞，而樹木的再生周期較長，樹皮再生慢，且易受病蟲害侵害，環剝將造成樹木死亡，長此以往，白蠟屬樹木資源會趨于枯竭，違背了科學發展觀的可持續發展思想。利用植物細胞工程手段，培養大量懸浮細胞并分離其次生代謝產物，提高花曲柳懸浮培養體系中香豆素類物質的含量，且不受季節限制，這將對花曲柳香豆素類藥用成分生產和臨床應用及花曲柳物種的保護起到積極的推動作用。

以花曲柳懸浮培養愈傷組織團塊進行細胞工程、基因工程等研究有明顯優勢，原因之一是愈傷組織團塊取材少，生長速度快，組織形成穩定結構，次生代謝產物產量高，受其他細胞和微環境影響不大，遺傳學上也比較穩定；其次是愈傷組織團塊繼代周期短，增殖速度快，通過再分化手段對再生植株進行選擇培養，也可以縮短育種年限，對保護物種有重要意義。目前，花曲柳愈傷組織培養研究外植體材料來源主要為休眠芽萌發莖段、無菌種子萌發的莖段。愈傷組織誘導植株再生及懸浮培養體系的建立尚未見報道。

發明內容

本發明目的是建立一種花曲柳懸浮培養體系的方法，該法簡單易行，操作性強，增殖系數可觀，能夠促進花曲柳的快速繁殖。

為達到上述目的，本發明采用以下技術措施：

步驟一，以花曲柳的莖段和葉片作為外植體，首先用75%酒精浸泡25-30s，然后用飽和Ca(ClO)₂水溶液處理8～12min，最后用無菌水沖洗4-6次；

步驟二，將消毒好的莖段(或葉片)在培養皿中用無菌刀切割成0.5-1cm(或cm²)左右的小段(或塊)，接種于固體WPM基本培養基附加NAA(a-naphthalene?acetic?acid)1.2-1.8mg/L、TDZ(thidiazuron)0.05-0.1mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂5.3g/L、pH6.0～6.5。

步驟三，光照培養，溫度23～26℃，每天光照16h，培養30d；

步驟四，將誘導出的愈傷組織用無菌刀切成0.5-1cm²，接種到含有約50mL液體培養基的100mL的三角瓶中，每瓶接種愈傷組織30-50塊，置于轉速為110-140r/min的搖床上，溫度23-26℃，每天光照16h，培養7-14d繼代一次。培養基使用1/2WPM基本培養基附加NAA(a-naphthalene?acetic?acid)0.7-1.4mg/L、TDZ(thidiazuron)0.03-0.07mg/L、蔗糖20g/L、pH6.0～6.5。

本發明的優點是：利用花曲柳莖段誘導形成的愈傷組織，誘導率達到100%，進一步建立愈傷組織團塊懸浮培養體系，每14天增殖3-5倍，愈傷組織緊密，干物質含量高，有利于次生代謝產物的積累，本發明建立的懸浮體系可用于生物反應器培養和擴大生產。

本發明方法簡單易行，操作性強，增殖系數可觀，能夠促進花曲柳的快速繁殖。。

附圖說明：懸浮培養7d的花曲柳愈傷組織。

附圖說明

圖1花曲柳懸浮細胞側面觀察圖

圖2花曲柳懸浮細胞底部觀察圖

具體實施方式：

一種水曲柳懸浮培養體系的建立方法，其具體步驟如下：

步驟一，以花曲柳莖段和葉片作為外植體，用75%酒精浸泡25s或28s或30s，用飽和Ca(ClO)₂水溶液處理8min或10min或12min，用無菌水沖洗4次或5次或6次；