[發(fā)明專利]多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310109045.8
• 申請(qǐng)日: 2013-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN104069488A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高強(qiáng);董珊珊;王新立;蔡芳;戈小琴;尹衛(wèi)東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京科興中維生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/09
• 分類號(hào): A61K39/09;A61K47/48;C08B37/00;A61P31/04
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物及其制備方法。

背景技術(shù)

肺炎鏈球菌（Streptococcus?pneumoniae）可引起腦膜炎、肺炎等侵入性疾病和中耳炎等非侵入性疾病。據(jù)聯(lián)合國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年有超過一百萬的兩歲以下兒童死于肺炎球菌引起的疾病。目前，針對(duì)肺炎鏈球菌的主要防御手段為多糖疫苗和結(jié)合疫苗，已經(jīng)證實(shí)了前者在成年人中的保護(hù)效果，但是對(duì)于肺炎鏈球菌的主要易感人群，嬰兒和幼兒中的保護(hù)力卻很弱。結(jié)合疫苗因其可以在嬰幼兒中引起有效保護(hù)和免疫記憶，自2000年首次問世以來，在全世界許多國(guó)家被納入免疫計(jì)劃或批準(zhǔn)上市。

目前我國(guó)僅有7價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗被批準(zhǔn)上市，僅能保護(hù)7個(gè)價(jià)次，保護(hù)范圍有限，而象其他10價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevenar其血清型組合主要針對(duì)歐美發(fā)達(dá)國(guó)家流行情況而設(shè)計(jì)，對(duì)我國(guó)特有的血清型缺乏保護(hù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物、其制備方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述共軛組合物的多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，其是包括14種不同血清型肺炎鏈球菌（Streptococcus?pneumoniae）莢膜多糖和載體蛋白質(zhì)共價(jià)連接形成的共軛組合物；其中，所述14種不同血清型包括1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。

本發(fā)明的一種多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，其是由14種不同血清型肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白質(zhì)共價(jià)連接形成的共軛組合物；其中，所述14種不同血清型為1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。

前述的多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，莢膜多糖與載體蛋白質(zhì)的重量比為1:2-2:1，各血清型莢膜多糖的質(zhì)量為血清型1：血清型4：血清型5：血清型6A：血清型7F：血清型9V：血清型14：血清型18C：血清型19A：血清型19F：血清型22F：血清型23F：血清型33F：血清型6B=1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2。

前述的多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，所述載體蛋白質(zhì)應(yīng)為無毒性，且能與肺炎莢膜多糖結(jié)合并且能夠引起多糖免疫原性顯著升高的蛋白質(zhì)，同時(shí)易于大量獲得。本發(fā)明的載體蛋白質(zhì)優(yōu)選為白喉類毒素或破傷風(fēng)毒素，更優(yōu)選為白喉類毒素CRM197。上述蛋白質(zhì)載體的獲得，需經(jīng)過菌體發(fā)酵、超濾、純化、脫毒等步驟，均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。

本發(fā)明還提供制備所述多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物的方法，分別對(duì)14種不同血清型（1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F）肺炎鏈球菌的莢膜多糖進(jìn)行分離純化，然后將各血清型莢膜多糖分別與載體蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)連接（例如，先將純化的莢膜多糖化學(xué)活化，通過還原胺化法將活化莢膜多糖分別單獨(dú)結(jié)合到載體蛋白上），形成單價(jià)共軛物，最后將各型單價(jià)共軛物混合，即得多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物。

其中，肺炎鏈球菌莢膜多糖分離純化的步驟為：

1）建立肺炎球菌菌種庫(kù)，采用工作種子進(jìn)行肺炎球菌發(fā)酵；

2）向肺炎球菌發(fā)酵液中加入適量的去氧膽酸鈉進(jìn)行殺菌并剝離肺炎莢膜多糖；

3）對(duì)殺菌后的發(fā)酵液進(jìn)行離心，去除菌體，收集離心上清，然后進(jìn)行超濾濃縮；

4）向濃縮液中加入無水乙醇，使乙醇終濃度為25%～45%，攪拌后離心去除核酸；

5）向上清中加入乙醇使其終濃度達(dá)到55%～80%，攪拌后，離心，去除上清收集沉淀；

6）加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液體積的苯酚進(jìn)行多次抽提，去除蛋白；

7）向上清中加入乙醇，使其終濃度達(dá)到55%～80%，離心后收集沉淀，即得純化的肺炎球菌莢膜多糖。

還可采用本領(lǐng)域熟知的其它純化技術(shù)，如柱層析等方法對(duì)肺炎鏈球菌莢膜多糖進(jìn)行純化。

本發(fā)明還提供所述多價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物在制備用于預(yù)防或治療肺炎鏈球菌所致疾病的藥物中的應(yīng)用。