[發(fā)明專利]一種密度感應(yīng)淬滅菌的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310108647.1
• 申請(qǐng)日: 2013-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103215342A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張曉華;湯開(kāi)浩;史曉翀;張?zhí)N慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/34
• 分類號(hào): C12Q1/34;C12Q1/02;C12R1/01
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國(guó)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水產(chǎn)微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種密度感應(yīng)淬滅菌的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

隨著國(guó)內(nèi)海水養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，集約化程度也不斷提高。但是伴隨而來(lái)的如養(yǎng)殖水體的污染，有害病菌的大量繁殖等一系列問(wèn)題也不斷出現(xiàn)，致使我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大的損失。目前對(duì)于病害的控制一方面通過(guò)提高養(yǎng)殖水體質(zhì)量、降低養(yǎng)殖密度等手段保障健康的養(yǎng)殖環(huán)境，另一方面通過(guò)注射疫苗、使用免疫增強(qiáng)劑等手段提高養(yǎng)殖動(dòng)物自身的抗病害能力。但是當(dāng)病害大規(guī)模發(fā)生時(shí)，使用廣譜抗生素還是最普遍的手段。然而，抗生素不僅僅可以抑制或殺滅病原微生物，還能抑制有益微生物，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)外微生態(tài)平衡的破壞。由此帶來(lái)的藥物殘留、細(xì)菌耐藥性等問(wèn)題，已經(jīng)成為阻礙我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。因此，尋找經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的水產(chǎn)病害防治方法已經(jīng)成為海水養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的迫切要求。相應(yīng)的，密度感應(yīng)抑制技術(shù)作為抗生素的替代手段來(lái)進(jìn)行海水養(yǎng)殖病害防治，因具有不易產(chǎn)生細(xì)菌抗藥性、不會(huì)破壞養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)外的微生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的重視。

密度感應(yīng)(quorum?sensing，QS)是一種微生物之間群體密度依賴性的基因調(diào)控機(jī)制。細(xì)菌在生長(zhǎng)的過(guò)程中，會(huì)合成一類小分子物質(zhì)稱為（autoinducers，AIs），通過(guò)自由擴(kuò)散或主動(dòng)運(yùn)輸釋放到周圍環(huán)境中。自誘導(dǎo)物的濃度隨著環(huán)境中細(xì)菌群體數(shù)量的增加而增加，當(dāng)其達(dá)到閾值濃度后，與受體蛋白結(jié)合，觸發(fā)信號(hào)的傳遞，激活或抑制相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而同步調(diào)控細(xì)菌整個(gè)群體的行為，以此來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。目前已經(jīng)報(bào)道的信號(hào)分子主要有革蘭氏陰性菌的N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯分子（N-acyl?homoserine?lactone，AHL）、革蘭氏陽(yáng)性菌的寡肽分子（autoinducing?peptide，AIP）以及在革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌中普遍存在的AI-2分子。

近幾年的研究證明，AHL類的QS系統(tǒng)和致病菌的致病性密切相關(guān)，如銅綠假單胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）利用QS系統(tǒng)來(lái)調(diào)控其生物膜的形成和抗藥性的產(chǎn)生；胡蘿卜歐文氏菌（Erwinia?carotovora）是一種植物病原菌，利用AHL類的QS系統(tǒng)來(lái)調(diào)控植物細(xì)胞壁降解酶的表達(dá)；鰻弧菌（Vibrio?anguillarum）擁有2套AHL類的QS系統(tǒng)（LuxM/N系統(tǒng)和VanI/R系統(tǒng)），以此來(lái)調(diào)控金屬蛋白酶、色素等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

而密度感應(yīng)淬滅（quorum?quenching，QQ）是指通過(guò)干擾信號(hào)分子的產(chǎn)生、釋放、信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及降解信號(hào)分子等方式達(dá)到阻抑QS通路的作用。密度感應(yīng)抑制技術(shù)即通過(guò)密度感應(yīng)淬滅作用，干擾密度感應(yīng)系統(tǒng)，在不殺死細(xì)菌的情況下特異性阻斷致病菌毒力基因的表達(dá)，在有效預(yù)防和控制病害的同時(shí)而不破壞海水養(yǎng)殖動(dòng)物微生物生態(tài)環(huán)境。另外QQ作用對(duì)細(xì)菌并不會(huì)產(chǎn)生“生”或“死”的選擇壓力，理論上來(lái)說(shuō)幾乎不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌抗藥性等問(wèn)題。因此深入探索密度感應(yīng)抑制技術(shù)，發(fā)展環(huán)境友好型病害防治手段對(duì)我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前發(fā)現(xiàn)的AHL類的QS系統(tǒng)的密度感應(yīng)淬滅活性物質(zhì)主要有信號(hào)分子降解酶和QS阻抑小分子物質(zhì)。小分子阻抑物主要有呋喃酮、肉桂醛及其衍生物和信號(hào)分子類似物。動(dòng)物模型侵染實(shí)驗(yàn)表明呋喃酮和肉桂醛等小分子阻抑物能夠大大降低哈維氏弧菌和銅綠假單胞菌等致病菌的致病性。目前在很多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了信號(hào)分子降解酶，根據(jù)降解機(jī)制的不同可分為三類：AHL內(nèi)酯酶（內(nèi)酯環(huán)水解作用），AHL酰基轉(zhuǎn)移酶（氨基水解作用）以及AHL氧化還原酶（氧化還原作用）。AHL降解酶尤其是AHL內(nèi)酯酶對(duì)不同長(zhǎng)度酰基鏈的信號(hào)分子（C4-C12）均具有高效的降解活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中過(guò)量表達(dá)的AHL內(nèi)酯酶(AiiA)和嗜水氣單胞菌混合注射鯉魚(yú)能大大降低鯉魚(yú)的致死率。AHL降解菌株的富集培養(yǎng)液能提高鹵蟲(chóng)和大菱鲆的成活率以及增強(qiáng)羅氏沼蝦對(duì)哈維氏弧菌的抵抗力。因此在防治海水養(yǎng)殖病害方面，密度感應(yīng)淬滅菌株具有很廣闊的發(fā)展前景。但目前還沒(méi)有有效的對(duì)環(huán)境中是否存在密度感應(yīng)淬滅菌進(jìn)行檢測(cè)的方法。