[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310107851.1
• 申請(qǐng)日: 2013-03-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103205494A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳澤祥;李軍;彭昊;楊威;許力干;謝宇舟;禤雄標(biāo);胡帥;馬春霞;謝永平;潘艷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 廣州市紅荔專(zhuān)利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是涉及一種快速、實(shí)時(shí)定量檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法。

背景技術(shù)

副豬嗜血桿菌（HPS）是一種不運(yùn)動(dòng)性、小型、NAD依賴(lài)、多形態(tài)的革蘭氏陰性桿菌，是豬上呼吸道的一種常在菌。衛(wèi)生狀況良好和較為健康的豬群，當(dāng)遭遇應(yīng)激因素易暴發(fā)該菌引起的病，常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎，影響2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段，5周齡~8周齡的豬發(fā)病率達(dá)40%，嚴(yán)重時(shí)死亡率達(dá)50%。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)副豬嗜血桿菌的診斷主要有傳統(tǒng)的病原分離、血清學(xué)以及基于PCR的檢測(cè)方法。病原學(xué)方法是對(duì)細(xì)菌的分離和鑒定，副豬嗜血桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，且菌株比較脆弱，從病科中分離率較低。副豬嗜血桿菌各血清型之間存在交叉反應(yīng)，血清學(xué)診斷結(jié)果不一致且不準(zhǔn)確。常規(guī)PCR檢測(cè)方法是選擇副豬嗜血桿菌的16S?rRNA的基因序列在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)引物，?16S?rRNA可以作為種屬的劃分依據(jù)但卻不能區(qū)分巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌，且在檢驗(yàn)中容易誤檢造成假陽(yáng)性。

本發(fā)明以副豬嗜血桿菌的infB基因作為檢測(cè)目標(biāo)，16SrRNA中的基因序列設(shè)計(jì)合成引物。infB是副豬嗜血桿菌的轉(zhuǎn)錄起始因子(?Translation?initiation?factor?2)?基因序列，在種屬間的變異率低且兼顧不同血清型之間的保守序列，因而可以作為通用性基因來(lái)監(jiān)測(cè)副豬嗜血桿菌。

血清學(xué)診斷存在特異性不高，敏感性低的特點(diǎn)，而傳統(tǒng)PCR檢測(cè)需要經(jīng)過(guò)變性--退火--延伸，加上DNA提取整個(gè)過(guò)程大概需要2~4小時(shí)才能得出結(jié)果。以往技術(shù)中所用到的LAMP方法檢測(cè)也需要1小時(shí)后加入染料才能判斷結(jié)果，反應(yīng)中加入的熒光染料syber-green，需采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，存在開(kāi)蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染，缺乏對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控很難排除這些干擾因素，不能對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出準(zhǔn)確的判定。

發(fā)明內(nèi)容?????????????????????????????????????????

本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡(jiǎn)便、快捷準(zhǔn)確地檢測(cè)副豬嗜血桿菌的方法，公開(kāi)一種快速、實(shí)時(shí)定量的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法。

本發(fā)明提供的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，該檢測(cè)方法包括材料的準(zhǔn)備、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、細(xì)菌的前處理、LAMP反應(yīng)體系建立以及LAMP檢測(cè)方法，以上所述的LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法，反應(yīng)溫度為63℃，反應(yīng)在20-35min間出現(xiàn)擴(kuò)增，引物包括外引物和內(nèi)引物；

所述的外引物是F3和B3；

所述的內(nèi)引物是FIP和BIP；

其中引物的序列分別為：

F3???CGAAAGCAACGGATATCGT

B3??CACCACCGAATTTCTCAGAA????????

FIP?CTGCTTTCGCGTGTTGGATTGCTCTTGTAGTAGCAGCTGACG

BIP?GCCGATCGTGGTTGCGGTAAACTCTTGTTCTACACGCTCT。

以上所述的細(xì)菌的前處理是將細(xì)菌直接加入PBS煮沸。

以上所述的LAMP反應(yīng)體系建立中LAMP反應(yīng)體系以25μl計(jì)：

??2×反應(yīng)緩沖液?????????????????????????12.5μl

FIP??????????????????????????????????40pmol

??BIP??????????????????????????????????40pmol

??F3???????????????????????????????????5pmol

??B3???????????????????????????????????5pmol

??LF???????????????????????????????????20pmol

??LB???????????????????????????????????20pmol

模板??????????????????????????????????2μl

??超純水????????????????????????????????補(bǔ)足25μl

以上所述的LAMP檢測(cè)方法包括實(shí)時(shí)濁度儀。

以上所述的LAMP檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)方式。

以上所述的LAMP檢測(cè)方法采用密閉全程監(jiān)控。