[發(fā)明專(zhuān)利]一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310103760.0
• 申請(qǐng)日: 2010-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103289918A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡俊鵬;陳小紅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;A61K35/74;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮椤?01010270772.9”的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為“2010年8月31日”，申請(qǐng)?zhí)枮椤?01010270772.9”，發(fā)明名稱(chēng)為“一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應(yīng)用”。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各種物理和/或化學(xué)的方法，包括各種抗生素的使用。物理和/或化學(xué)的方法都存在著明顯的弊端，首先，抗生素大量濫用，會(huì)導(dǎo)致一些副作用的產(chǎn)生，如病原菌的抗藥性、抑制有益菌群等。其次，酸堿處理的方法雖可達(dá)到一定的滅菌/殺菌效果，但在有害菌形成生物膜后，這些方法的效果就極不理想。最后，物理的方法對(duì)各種致病菌的消除作用只能應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域的某一環(huán)節(jié)，而難以擴(kuò)展到整個(gè)領(lǐng)域的所有環(huán)節(jié)。生物防治的方法則可具有強(qiáng)大的優(yōu)越性，極有可能使其服務(wù)于日常生活的病害防治以及生物戰(zhàn)和恐怖襲擊中大規(guī)模的水源性、食源性污染的處理等。

近年來(lái)微生物生態(tài)制劑的研究開(kāi)發(fā)受到各方關(guān)注，特別是蛭弧菌的研究受到人們的青睞。蛭弧菌自1963年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因其是一種寄生菌，能裂解大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、嗜水氣單胞菌、弧菌等革蘭氏陰性致病菌且對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害，而備受關(guān)注。

將蛭弧菌應(yīng)用于防治致病菌的關(guān)鍵是獲得濃度高、裂解能力強(qiáng)的蛭弧菌制劑。為此，人們對(duì)蛭弧菌制劑的制備方法進(jìn)行了不懈的研究，譬如專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?3111749.6、名稱(chēng)為“生物制菌王及其生產(chǎn)方法”的國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)岢鲇酶邷兀?0～150℃）或化學(xué)藥物（氯仿等）將大腸桿菌殺死，制造滅活的宿主菌，接著用其培養(yǎng)蛭弧菌，得到蛭弧菌制劑；專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00810145709.5、名稱(chēng)為“蛭弧菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)方法”提供了蛭弧菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)方法，主要和傳統(tǒng)方法不同的是將宿主大腸桿菌凍干成菌粉使用。上述兩份專(zhuān)利申請(qǐng)都采用活的大腸桿菌作為宿主菌，最終會(huì)影響生態(tài)環(huán)境。而本發(fā)明所用的宿主菌均為有益菌或是對(duì)環(huán)境無(wú)害的菌，不會(huì)對(duì)環(huán)境構(gòu)成威脅。專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00810202809.7、名稱(chēng)為“雙效蛭弧菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法”的國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N雙效蛭弧菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，即先發(fā)酵制備宿主菌的混懸液，再加入宿主菌混懸液和蛭弧菌液到配制好的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵。雖然該生產(chǎn)方法生產(chǎn)出的蛭弧菌含量較高（5×10⁸pfu/mL），但是其宿主菌選用了致病性的嗜水氣單胞菌，而且發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)（72～120h），會(huì)導(dǎo)致其生產(chǎn)成本的增加。另外，此技術(shù)也可能存在著所得的蛭弧菌裂解活性不高的問(wèn)題。而本發(fā)明采用的是革蘭氏陽(yáng)性菌為宿主，實(shí)驗(yàn)證明，以此宿主發(fā)酵制得的蛭弧菌能夠維持，甚至提高對(duì)其他革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的裂解能力。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有方法所制備的蛭弧菌制劑含量低以及裂解活性低的問(wèn)題，本發(fā)明的首要目的在于提供一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述發(fā)酵方法制備得到的蛭弧菌制劑。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述蛭弧菌制劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，包括以下步驟：

（1）宿主菌懸液的制備

將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體，接著用磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度，得到濃度為10¹⁷～10²²cfu/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2～15℃中保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）蛭弧菌游泳體濃縮液的制備：

在磷酸鹽緩沖液中加入步驟（1）制備的宿主菌懸浮液，調(diào)整宿主菌的濃度為10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后將此培養(yǎng)液在20～40℃培養(yǎng)20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm離心15～35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在2～15℃，12000～20000rpm離心15～40min，保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為10⁶～10⁹pfu/mL，得到蛭弧菌游泳體濃縮液，置于2～15℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）蛭弧菌制劑的制備：