[發(fā)明專利]一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310103760.0
• 申請(qǐng)日: 2010-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103289918A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡俊鵬;陳小紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A61K35/74;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

1.一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）宿主菌懸液的制備：

將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度，得到濃度為10¹⁷～10²²cfu/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2～15℃中保存?zhèn)溆茫凰鏊拗骶鸀榧S腸球菌（Enterococcus?faecalis）CGMCC1.131；

（2）蛭弧菌游泳體濃縮液的制備：

在磷酸鹽緩沖液中加入步驟（1）制備的宿主菌懸浮液，調(diào)整宿主菌的濃度為10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后將此培養(yǎng)液在20～40℃培養(yǎng)20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm離心15～35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在2～15℃，12000～20000rpm離心15～40min，保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡海恋頌轵位【斡倔w，在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為10⁶～10⁹pfu/mL，得到蛭弧菌游泳體濃縮液，置于2～15℃保存?zhèn)溆茫凰鲵位【鸀锽DFM05，BDFM05于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M209172；

（3）蛭弧菌制劑的制備：

將溶劑滅菌，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟（1）制備的宿主菌懸浮液和步驟（2）制備的蛭弧菌游泳體濃縮液，使宿主菌起始濃度為10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，蛭弧菌游泳體起始濃度為10¹～10³pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵溫度控制在28～30℃，pH值控制在7.2～7.6；設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在20%～30%；發(fā)酵過(guò)程中加1～3次宿主菌懸浮液，每次加入宿主菌懸浮液的間隔時(shí)間12～18h，每次加入宿主菌懸浮液的量以新加入的宿主菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10¹⁰～10¹⁵cfu/mL為準(zhǔn)；發(fā)酵培養(yǎng)36～48h即制成蛭弧菌制劑；所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基、蒸餾水或磷酸鹽緩沖液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于：步驟（1）所述收集菌體的方式為通過(guò)離心分離得到，離心條件為2～15℃，5000～8000rpm離心15～35min；所述宿主菌懸浮液的濃度為10¹⁷～10²²cfu/mL；步驟（1）～（3）任一項(xiàng)所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.1～0.3mol/L，pH為7.2～7.6；步驟（2）所述蛭弧菌游泳體濃縮液的濃度為10⁸～10¹²pfu/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于：步驟（3）所述滅菌的條件為121℃滅菌20min；所述蛭弧菌制劑的濃度為10⁸～10¹²pfu/mL；所述DNB液體培養(yǎng)基是將營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.6。

4.一種蛭弧菌制劑，由權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述方法制備得到。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛭弧菌制劑在制備防治表皮葡萄球菌和大腸桿菌藥物中的應(yīng)用。