[發明專利]一種微生物發酵生產吡咯喹啉醌的方法及所用的發酵培養基

有效

• 申請號: 201310102933.7
• 申請日: 2013-03-27
• 公開（公告）號: CN103224965A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 葛欣;張惟材;熊向華;汪建華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 北京維澳專利代理有限公司 11252
• 代理人: 王立民

技術領域

本發明涉及微生物發酵技術研究領域，具體的涉及一種微生物發酵高效生產吡咯喹啉醌（PQQ）的方法及所用的發酵培養基。

背景技術

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline?quinone，PQQ）是第三類氧化還原酶的輔酶，也是被稱為一種新的維生素，具有多種生理功能，在防治肝損傷和肝中毒、促進神經生長因子生成、調節自由基水平，抗輻射損傷、心血管疾病和糖尿病等方面有重要醫用價值。

目前PQQ主要是化學合成法，微生物合成具有清潔低碳、溫和可控、成本低廉等優勢，是一種極具潛力的生產方式。影響微生物發酵生產PQQ大規模應用的主要因素有：（1）適合于工業生產的微生物不多；（2）文獻報道的PQQ生產菌株生產周期長，產率不高；（3）PQQ作為一種輔酶，并不是微生物的次級代謝產物，其合成調控受培養條件和代謝調控的嚴格制約。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種能使PQQ合成量增加的培養方法和發酵培養基，摸索一條行之有效的微生物發酵生產PQQ的控制方法，實現利用甲基營養菌高效生產PQQ的目的。

本發明的另一目的是提供一種發酵制備所述PQQ的發酵培養基。

為了實現本發明的目的，本發明提供了一種微生物發酵生產吡咯喹啉醌的方法，其包括如下步驟：

（1）活化菌種：將原始菌種甲基營養菌Methylovorus?sp.MP688接種到固體培養基中，在適合原始菌種生長的條件下進行培養，得活化的菌種；

（2）種子液的培養：將步驟（1）所得活化好的菌種接種到液體培養基中，在適合菌體生長的條件下進行培養，得種子培養液；

（3）發酵罐發酵：將步驟（2）所得種子培養液按比例接種到含有發酵培養基的發酵罐中；發酵培養過程中溫度恒定，同時，發酵罐的pH、溶解氧和攪拌轉速采用兩階段控制策略；氮源補料采用pH-氮源聯控方式進行，碳源補料采用間歇補料方式進行；

（4）收獲發酵液，得吡咯喹啉醌。

進一步地，本發明提供了以下優選的技術方案：

其中，所述甲基營養菌Methylovorus?sp.MP688，已于2010年8月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCCNo.4096。（詳細信息請參見中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所申請的專利號為201010548511.9的發明專利）。

優選的，步驟（1）中所述培養溫度為30～35℃，培養時間為2～3天；所述固體培養基為在基本培養基的基礎上添加瓊脂粉和碳源甲醇，所述瓊脂粉在所述固定培養基中的濃度為1～2g/L，所述甲醇在所述固定培養基中的濃度為7.5～15g/L，其中，所述基本培養基的組分及配比如下：

基本培養基（以1L計）

MgSO₄·7H₂O????????0.4-1g，

(NH₄)₂SO₄??????????3-5g，

KH₂PO₄?????????????1.4g，

Na₂HPO₄·12H₂O?????3g，

檸檬酸鐵???????????10-30mg，

CaCl₂??????????????10-30mg，

MnCl₂·4H₂O????????5-10mg，

ZnSO₄·7H₂O????????5-10mg，

CuSO₄·5H₂O????????0.5-2mg，

葉酸???????????????0.02-0.05mg，

生物素?????????????0.02-0.05mg，

核黃素????0.02-0.05mg，

煙酸??????0.02-0.05mg，

硫辛酸????0.02-0.05mg。