[發明專利]一種蛭弧菌制劑及其發酵方法和應用

有效

• 申請號: 201310102347.2
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN103320344A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 蔡俊鵬;陳小紅
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K35/74;A61P31/04;C12R1/46;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

本發明專利申請是申請號為“201010270772.9”的分案申請，原申請的申請日為“2010年8月31日”，申請號為“201010270772.9”，發明名稱為“一種蛭弧菌制劑及其發酵方法和應用”。

技術領域

本發明涉及發酵技術領域，具體涉及一種蛭弧菌制劑及其發酵方法與應用。

背景技術

目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各種物理和/或化學的方法，包括各種抗生素的使用。物理和/或化學的方法都存在著明顯的弊端，首先，抗生素大量濫用，會導致一些副作用的產生，如病原菌的抗藥性、抑制有益菌群等。其次，酸堿處理的方法雖可達到一定的滅菌/殺菌效果，但在有害菌形成生物膜后，這些方法的效果就極不理想。最后，物理的方法對各種致病菌的消除作用只能應用于相關領域的某一環節，而難以擴展到整個領域的所有環節。生物防治的方法則可具有強大的優越性，極有可能使其服務于日常生活的病害防治以及生物戰和恐怖襲擊中大規模的水源性、食源性污染的處理等。

近年來微生物生態制劑的研究開發受到各方關注，特別是蛭弧菌的研究受到人們的青睞。蛭弧菌自1963年被發現以來，因其是一種寄生菌，能裂解大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、弧菌等革蘭氏陰性致病菌且對人和動物無害，而備受關注。

將蛭弧菌應用于防治致病菌的關鍵是獲得濃度高、裂解能力強的蛭弧菌制劑。為此，人們對蛭弧菌制劑的制備方法進行了不懈的研究，譬如專利申請號為93111749.6、名稱為“生物制菌王及其生產方法”的國家發明專利申請提出用高溫（70～150℃）或化學藥物（氯仿等）將大腸桿菌殺死，制造滅活的宿主菌，接著用其培養蛭弧菌，得到蛭弧菌制劑；專利申請號200810145709.5、名稱為“蛭弧菌微生態制劑的生產方法”提供了蛭弧菌微生態制劑的生產方法，主要和傳統方法不同的是將宿主大腸桿菌凍干成菌粉使用。上述兩份專利申請都采用活的大腸桿菌作為宿主菌，最終會影響生態環境。而本發明所用的宿主菌均為有益菌或是對環境無害的菌，不會對環境構成威脅。專利申請號200810202809.7、名稱為“雙效蛭弧菌的發酵生產方法”的國家發明專利申請提供了一種雙效蛭弧菌的發酵生產方法，即先發酵制備宿主菌的混懸液，再加入宿主菌混懸液和蛭弧菌液到配制好的培養液中進行發酵。雖然該生產方法生產出的蛭弧菌含量較高（5×10⁸pfu/mL），但是其宿主菌選用了致病性的嗜水氣單胞菌，而且發酵時間較長（72～120h），會導致其生產成本的增加。另外，此技術也可能存在著所得的蛭弧菌裂解活性不高的問題。而本發明采用的是革蘭氏陽性菌為宿主，實驗證明，以此宿主發酵制得的蛭弧菌能夠維持，甚至提高對其他革蘭氏陰性菌和陽性菌的裂解能力。

發明內容

為了克服現有方法所制備的蛭弧菌制劑含量低以及裂解活性低的問題，本發明的首要目的在于提供一種蛭弧菌制劑的發酵方法。

本發明的另一目的在于提供一種由上述發酵方法制備得到的蛭弧菌制劑。

本發明的再一目的在于提供上述蛭弧菌制劑的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種蛭弧菌制劑的發酵方法，包括以下步驟：

（1）宿主菌懸液的制備

將宿主菌培養至對數生長期，收集菌體，接著用磷酸鹽緩沖液調整濃度，得到濃度為10¹⁷～10²²cfu/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2～15℃中保存備用；

（2）蛭弧菌游泳體濃縮液的制備：

在磷酸鹽緩沖液中加入步驟（1）制備的宿主菌懸浮液，調整宿主菌的濃度為10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后將此培養液在20～40℃培養20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm離心15～35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在2～15℃，12000～20000rpm離心15～40min，保留沉淀棄去上清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液調整蛭弧菌游泳體的濃度為10⁶～10⁹pfu/mL，得到蛭弧菌游泳體濃縮液，置于2～15℃保存備用；

（3）蛭弧菌制劑的制備：