[發明專利]一種蛭弧菌制劑及其發酵方法和應用

有效

• 申請號: 201310102347.2
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN103320344A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 蔡俊鵬;陳小紅
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K35/74;A61P31/04;C12R1/46;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

1.一種蛭弧菌制劑的發酵方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）宿主菌懸液的制備：

將宿主菌培養至對數生長期，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液調整濃度，得到濃度為10¹⁷～10²²cfu/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2～15℃中保存備用；所述宿主菌為乳酸鏈球菌（Streptococcus?lactis）GIM1.156；

（2）蛭弧菌游泳體濃縮液的制備：

在磷酸鹽緩沖液中加入步驟（1）制備的宿主菌懸浮液，調整宿主菌的濃度為10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后將此培養液在20～40℃培養20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm離心15～35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在2～15℃，12000～20000rpm離心15～40min，保留沉淀棄去上清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液調整蛭弧菌游泳體的濃度為10⁶～10⁹pfu/mL，得到蛭弧菌游泳體濃縮液，置于2～15℃保存備用；所述蛭弧菌為BDSM08，BDSM08于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M209171；

（3）蛭弧菌制劑的制備：

將溶劑滅菌，得到發酵培養基；在發酵培養基中加入步驟（1）制備的宿主菌懸浮液和步驟（2）制備的蛭弧菌游泳體濃縮液，使宿主菌起始濃度為10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，蛭弧菌游泳體起始濃度為10¹～10³pfu/mL，進行發酵；發酵溫度控制在28～30℃，pH值控制在7.2～7.6；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制在20%～30%；發酵過程中加1～3次宿主菌懸浮液，每次加入宿主菌懸浮液的間隔時間12～18h，每次加入宿主菌懸浮液的量以新加入的宿主菌在發酵培養基中的濃度為10¹⁰～10¹⁵cfu/mL為準；發酵培養36～48h即制成蛭弧菌制劑；所述溶劑為DNB液體培養基、蒸餾水或磷酸鹽緩沖液。

2.根據權利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發酵方法，其特征在于：步驟（1）所述收集菌體的方式為通過離心分離得到，離心條件為2～15℃，5000～8000rpm離心15～35min；所述宿主菌懸浮液的濃度為10¹⁷～10²²cfu/mL；步驟（1）～（3）任一項所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.1～0.3mol/L，pH為7.2～7.6；步驟（2）所述蛭弧菌游泳體濃縮液的濃度為10⁸～10¹²pfu/mL。

3.根據權利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發酵方法，其特征在于：步驟（3）所述滅菌的條件為121℃滅菌20min；所述蛭弧菌制劑的濃度為10⁸～10¹²pfu/mL；所述DNB液體培養基是將營養肉湯0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸餾水中，調節pH值至7.2～7.6。

4.一種蛭弧菌制劑，由權利要求1～3任一項所述方法制備得到。

5.根據權利要求4所述的蛭弧菌制劑在制備防治豬霍亂沙門氏菌和表皮葡萄球菌藥物中的應用。