[發(fā)明專利]一種植物表達(dá)載體pGⅡ0229-GUS的構(gòu)建及應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310102319.0
• 申請(qǐng)日: 2013-03-28
• 公開（公告）號(hào): CN103146736A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高世武;林慶良;郭晉隆;許莉萍;王天池;闕友雄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/82
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域　??

本發(fā)明涉及一種植物表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用，具體涉及一種植物表達(dá)載體pGⅡ0229-GUS的構(gòu)建及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)????

甘蔗（Saccharum?Complex）是最主要的糖料作物，蔗糖占世界食糖總產(chǎn)的76%，占我國(guó)食糖總產(chǎn)的92%；甘蔗也是最重要的生物質(zhì)能源作物之一，是迄今大田栽培作物中單位面積生物量和燃料乙醇產(chǎn)量最大的C4植物。甘蔗品種改良對(duì)產(chǎn)業(yè)科技進(jìn)步貢獻(xiàn)率高達(dá)60%，但是甘蔗是高度雜合的無性繁殖作物，遺傳背景非常復(fù)雜，表現(xiàn)為異源多倍體和多倍的非整倍體，染色體個(gè)數(shù)40～120個(gè)不等，變化幅度之大為其它作物所不及，常規(guī)有性雜交育種，從實(shí)生苗開始一般需要10～13年才能從10～30萬(wàn)株分離群體中培育出1個(gè)達(dá)到審（鑒）定要求的品種。

現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展和研究技術(shù)手段的進(jìn)步，使品種的定向改良和目標(biāo)性狀育種成為可能。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良甘蔗品種具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，原因在于：（1）甘蔗屬于轉(zhuǎn)基因安全等級(jí)為I級(jí)的工業(yè)原料作物，批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因甘蔗產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用相對(duì)容易；（2）甘蔗又是無性繁殖作物，只要選到優(yōu)良的單株就可以通過離體無性繁殖的方式，快速擴(kuò)大群體并保持遺傳上的穩(wěn)定性。目前甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有兩個(gè)途徑，一是基因槍轟擊法，二是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，二者在甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化上已經(jīng)有應(yīng)用實(shí)例，但是這兩種技術(shù)在甘蔗轉(zhuǎn)基因應(yīng)用上，轉(zhuǎn)化效率都很低。為了提高甘蔗轉(zhuǎn)化效率，仍需進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化。但是目前用于體系優(yōu)化的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化效率低，不利于對(duì)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。為此，為了建立更好的甘蔗轉(zhuǎn)基因優(yōu)化體系，我們探討了一個(gè)新的瞬時(shí)植物表達(dá)載體構(gòu)建及其在甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用，目的是獲得一個(gè)瞬時(shí)表達(dá)效率高的載體，從而能更有效地對(duì)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而建立一種可實(shí)現(xiàn)甘蔗高效轉(zhuǎn)化的技術(shù)方法，為甘蔗轉(zhuǎn)基因改良提供技術(shù)支撐。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種植物表達(dá)載體pGⅡ0229-GUS的構(gòu)建方法及應(yīng)用。針對(duì)現(xiàn)有甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化時(shí)所用載體瞬時(shí)表達(dá)效率不高問題，提供一種轉(zhuǎn)化效率高的載體。通過克隆獲得瞬時(shí)基因表達(dá)盒，進(jìn)而將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，獲得一個(gè)新的瞬時(shí)植物表達(dá)載體，提高轉(zhuǎn)化效率，從而建立更好的甘蔗外源基因遺傳轉(zhuǎn)化體系。?

本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的。?

本發(fā)明的一種植物表達(dá)載體pGⅡ0229-GUS的構(gòu)建方法，包括引物設(shè)計(jì)、基因克隆和載體構(gòu)建；其特征在于操作步驟如下：?

1、引物設(shè)計(jì)：人工設(shè)計(jì)合成特異引物序列

Forward?primer:?5’-?GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC?-?3’

Reverse?primer:?5’-?GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC?-?3’；

　??2、PCR擴(kuò)增：?PCR反應(yīng)體系是10×PCR?Buffer?2.5?μl，dNTP?2.0?μl，10?μmol/L的Forward?primer?1.0?μl，10?μmol/L的Reverse?primer?1.0?μl，5?U/μl的Ex?Taq?酶0.125?μl，100?ng/μl的DNA模板1.0?μl，加ddH₂O至終體積25?μl；PCR程序是95℃預(yù)變性5?min，95℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸3?min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10?min；所述DNA模板是以pCAMBIA2301質(zhì)粒為DNA模板；