[發明專利]一種植物表達載體pGⅡ0229-GUS的構建及應用

無效

• 申請號: 201310102319.0
• 申請日: 2013-03-28
• 公開（公告）號: CN103146736A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 高世武;林慶良;郭晉隆;許莉萍;王天池;闕友雄
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/82
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種植物表達載體pGⅡ0229-GUS的構建方法，包括引物設計、PCR擴增和載體構建；其特征在于：

（1）引物設計：人工設計合成特異引物序列

Forward?primer:?5’-?GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC?-?3’

Reverse?primer:?5’-?GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC?-?3’；

　??（2）PCR擴增：?PCR反應體系是10×PCR?Buffer?2.5?μl，dNTP?2.0?μl，10?μmol/L的Forward?primer?1.0?μl，10?μmol/L的Reverse?primer?1.0?μl，5?U/μl的Ex?Taq?酶0.125?μl，100?ng/μl的DNA模板1.0?μl，加ddH₂O至終體積25?μl；PCR程序是95℃預變性5?min，95℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸3?min，30個循環，最后72℃延伸10?min；所述DNA模板是以pCAMBIA2301質粒為DNA模板；

（3）載體構建：將步驟（2）的PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段Ⅰ，并將獲得的目的片段Ⅰ用限制性內切酶HindIII和XbaI進行酶切，回收目的片段Ⅱ，同時將pGreenII0229質粒DNA用限制性內切酶HindIII和XbaI進行酶切，回收目的片段Ⅲ，將回收的目的片段Ⅱ和目的片段Ⅲ用T4-DNA連接酶進行連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆驗證，獲得pGⅡ0229-GUS載體；所述目的片段Ⅰ是指用特異引物擴增出的含有35s啟動子、GUS瞬時表達基因和nos終止子的核酸片段；目的片段Ⅱ是指用限制性內切酶HindIII和XbaI酶切目的片段Ⅰ后2927bp的核酸片段；目的片段Ⅲ是指用限制性內切酶HindIII和XbaI酶切pGreenII0229質粒DNA后4406bp的核酸片段。

2.一種植物表達載體pGⅡ0229-GUS在農桿菌侵染轉化上應用。

3.一種植物表達載體pGⅡ0229-GUS在基因槍轟擊轉化上應用。