[發明專利]一種準確區分辣椒與甜椒的功能標記及其檢測引物組和檢測方法

無效

• 申請號: 201310102225.3
• 申請日: 2013-03-27
• 公開（公告）號: CN103173444A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 徐曉美;李穎;王恒明;徐小萬;黃智文;田永紅
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院蔬菜研究所;廣東科農蔬菜種業有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 張海文

技術領域

本發明屬于分子標記輔助育種領域，涉及一種準確區分辣椒與甜椒的功能標記及其檢測引物組和檢測方法。

背景技術

辣椒屬（Capsicum?L.）是一種重要的蔬菜作物，廣泛栽培于南北美洲、歐洲、亞洲、大洋洲等世界各地，根據形態學和細胞學特征分為5個栽培種，分別為Capsicum?annuum、C.?frutescens、C.?chinense、C.?baccatum?和?C.?pubescens,?其中?C.?annuum?是世界上栽培最廣泛、類型最豐富的栽培種，迄今在世界范圍內，辣椒育種主要在?C.?annuum?這個栽培種上展開(Pickersgill，1997)。

辣椒因其獨特的辣味而深受消費者的喜愛，不僅可以鮮食，還可以加工成辣椒醬、辣椒粉等，不僅如此，其果實中的辣椒素類物質在醫藥工業也具有廣泛的應用價值。因此，國內外學者對辣椒辣味的產生進行了深入研究，結果表明，辣椒辣味是由單一顯性基因Pun1（C基因）控制，它對所有其它辣味相關基因具有上位作用，當該基因為純合隱性時，即辣味缺失(Boswell，1937；?Webber，1912)。到目前為止，已鑒定出三個Pun1的自然突變等位基因，其中之一是來自C.?annuum的等位基因Pun?1¹，與Pun?1相比，Pun?1¹基因組序列存在一段橫跨啟動子區和第一外顯子區的約2.5kb的堿基缺失，導致該基因無法轉錄和翻譯，以致辣味缺失(Stewart?Jr?et?al，2005)。甜椒是辣椒的變種，攜帶Pun1的自然突變等位基因Pun?1¹。

在育種實踐中，育種家需要充分利用辣椒與甜椒的優良基因，并將其進行整合，傳統的育種方法是將兩者進行雜交并在大田中進行后代分離群體的選擇，這種傳統的選擇方法往往效率低且浪費大田資源，因此，建立一種高效準確的功能標記檢測技術是解決這一問題的有效途徑。

功能標記來源于控制表型的基因序列內部，是在鑒別基因序列的表型功能后，根據該基因的(復)等位基因序列多態性及其對應的表型效應，從而開發出能夠區分和預測(復)等位基因及相對性狀的DNA標記(Andersen?and?Lübberstedt，2003)。功能標記由于來源于基因內部而表現出與基因共分離，并與表型直接關聯，因此，在分子育種運用中與其它分子標記相比具有諸多優勢，主要表現在以下方面：一，準確可靠：由于與目標基因共分離，功能標記能夠避免由于重組交換而產生的選擇錯誤，在群體的目標基因檢測時更加有效；二，普遍適用：可以在多種不同的遺傳背景下應用，對人工育種群體和自然群體均有效；三，避免連鎖累贅：由于是來源于基因內部，直接反映目標性狀表現，因此利用回交轉育進行優良性狀的轉移時，功能標記的應用可以更好的避免連鎖累贅，減少供體不益基因向受體的導入。

辣椒（Capsicum?L.）相對于其它幾個模式植物而言其分子生物學研究起步較晚，精細定位和克隆的基因有限，因此，制約了功能標記的發展和運用，本發明在充分探明Pun1等位基因序列差異和表型效應的基礎上發展功能標記，加速功能標記在蔬菜分子育種和基礎研究中的運用進程。

發明內容

本發明的目的在于提供一種準確區分辣椒與甜椒的功能標記檢測引物、試劑盒及檢測方法。

本發明基于Pun1基因(GENBANK登錄號為：AY819029.1)的等位基因序列差異發展功能標記，巧妙地設計了3條引物，引物F1位于第一外顯子區，引物F2橫跨約2.5kb的缺失序列，引物R為公用引物（圖1）。當植株為辣椒時，只能是引物F1和R組合擴增出特異條帶1；當植株為甜椒時，只能是引物F2和R組合擴增出特異條帶2；當植株為辣椒與甜椒的雜合植株時，則2條特異帶同時擴增。

本發明所采取的技術方案是：

一種準確區分辣椒與甜椒的功能標記，其位于辣椒Pun1基因（SEQ?ID?NO.1）上的第27?bp～2587?bp。

一種準確區分辣椒與甜椒的PCR引物組，包括如下3條引物：

F1：GCCATCAGTGTATGCTTT（SEQ?ID?NO.2）；

F2：CATACCGCTCCACGGAAAAGAC（SEQ?ID?NO.3）；