[發明專利]細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物小孢子的方法在審

申請號：	201310101986.7	申請日：	2013-03-27
公開（公告）號：	CN104073519A	公開（公告）日：	2014-10-01
發明（設計）人：	劉凡;王桂香;宗梅;韓碩;秦瑩;張月云	申請（專利權）人：	北京市農林科學院
主分類號：	C12N15/87	分類號：	C12N15/87;A01H5/00
代理公司：	北京紀凱知識產權代理有限公司 11245	代理人：	關暢
地址：	100097 北***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物孢子方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物小孢子的方法。

背景技術

細胞穿透肽（cell-penetrating?peptides，CPPs）是一類在親水性及極性上變化很大的短肽。它們可以通過共價或非共價結合通過細胞膜，將其攜帶的大分子，如寡核苷酸、蛋白、藥物等帶入細胞，并可以通過分子設計，針對不同細胞器，實現細胞器定位轉基因，是近年新發展起來的一個具有廣闊應用前景的轉基因載體。目前研究工作主要集中在動物細胞上，植物上的應用研究剛剛開始（Chugh?et?al.,2010）。細胞穿透蛋白介導的轉基因技術具有高效，不需要選擇標記基因，不需要基因槍或農桿菌，物種依賴性弱，CPP種類多，選擇余地大，可攜帶的大分子種類多，可設計性強等許多突出優勢，目前在國際上成為生命科學研究，特別是基因工程技術研究的新熱點。它在干細胞基因工程，DNA、RNA、蛋白質、藥物分子的功能研究，利用基因定點突變的反向遺傳學研究，及至實現真正的分子育種上具有重要且深遠的研究及應用價值。

小孢子即發育早期的花粉細胞，是植物的生殖細胞，具有單倍性、單細胞、大群體的特點。利用游離小孢子培養系統的CPP轉基因可以一次性獲得大量純合的轉基因株。雖然小孢子是一個理想的轉基因受體材料，但由于花粉壁的特殊結構，造成壁厚、堅實，農桿菌或基因槍都難以操作的特點，小孢子的轉基因國際上一直是一個難題。建立CPP在作物上的應用技術，特別是在小孢子轉基因上的應用技術，不僅有利于理論研究的深入，更有益于后基因組時代對于基因功能的研究，以及利用基因工程的遺傳育種。

發明內容

本發明的目的是提供一種培育蕓薹屬轉基因植物的方法，該方法是利用細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物(Brassica)小孢子，包括如下步驟：將細胞穿透肽與目的DNA的復合體轉染處于單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞后，再將所述細胞經胚狀體誘導培養和植株再生培養，獲得導入所述目的DNA的蕓薹屬轉基因植株。

所述單核靠邊期是指小孢子細胞內的細胞質明顯液泡化形成中央大液泡，細胞核位于細胞內一側。

所述雙核早期是指單核靠邊期的小孢子細胞核發生一次分裂，形成了兩個緊鄰的細胞核。

所述胚狀體是指小孢子細胞經離體培養獲得的器官分化之前的胚胎。

在上述方法中，在所述轉染前，還可包括將所述處于單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞在溫度33℃、黑暗條件下、用所述細胞的胚狀體誘導培養基靜置懸浮培養12—24小時（如12、16或24小時）的步驟。

在上述方法中，在所述轉染后，將所述細胞經胚狀體誘導培養前，還可包括將所述細胞在溫度33℃、黑暗條件下、用所述細胞的胚狀體誘導培養基靜置懸浮培養2天的步驟。

在上述方法中，所述細胞穿透肽為序列表序列1所示的短肽；

和/或，所述目的DNA大小為1000—10000bp，具體可為1930bp、3230bp或7907bp。

和/或，所述復合體中的所述細胞穿透肽與所述目的DNA的質量比為4:1。

在上述方法中，所述轉染按照包括如下步驟的方法進行：

將濃度為40μg/ml的所述細胞穿透肽溶液與濃度為10μg/ml的所述目的DNA溶液等體積混合后，靜置15分鐘，得到含有所述復合體的溶液；

將轉染試劑與含有所述復合體的溶液按5μg：200μl的比例混合后靜置5分鐘，獲得轉染液；所述轉染試劑具體可為Invitrogen公司的產品目錄編號為Cat.NO11668-019的轉染試劑Lipofectamine。

將所述轉染液與所述細胞的懸浮培養液混合，于溫度33℃、黑暗條件下靜置45分鐘—1小時。