[發(fā)明專利]細胞穿透肽介導外源基因轉化蕓薹屬植物小孢子的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201310101986.7
• 申請日: 2013-03-27
• 公開（公告）號: CN104073519A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設計）人: 劉凡;王桂香;宗梅;韓碩;秦瑩;張月云
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種培育蕓薹屬轉基因植物的方法，包括如下步驟：

將細胞穿透肽與目的DNA的復合體轉染處于單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞后，再將所述細胞經胚狀體誘導培養(yǎng)和植株再生培養(yǎng)，獲得導入所述目的DNA的蕓薹屬轉基因植株。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：在所述轉染前，包括將所述處于單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞在溫度33℃、黑暗條件下、用所述細胞的胚狀體誘導培養(yǎng)基靜置懸浮培養(yǎng)12—24小時的步驟。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述轉染后，將所述細胞經胚狀體誘導培養(yǎng)前，包括將所述細胞在溫度33℃、黑暗條件下、用所述細胞的胚狀體誘導培養(yǎng)基靜置懸浮培養(yǎng)2天的步驟。

4.根據權利要求1—3中任一所述的方法，其特征在于：所述細胞穿透肽為序列表序列1所示的短肽；

和/或，所述目的DNA大小為1000—10000bp。

和/或，所述復合體中的所述細胞穿透肽與所述目的DNA的質量比為4:1。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述轉染按照包括如下步驟的方法進行：

將濃度為40μg/ml的所述細胞穿透肽溶液與濃度為10μg/ml的所述目的DNA溶液等體積混合后，靜置15分鐘，得到含有所述復合體的溶液；

將轉染試劑與含有所述復合體的溶液按5μg：200μl的比例混合后靜置5分鐘，獲得轉染液；

將所述轉染液與所述細胞的懸浮培養(yǎng)液混合，于溫度33℃、黑暗條件下靜置45分鐘—1小時。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：

所述轉染前，所述細胞的所述靜置懸浮培養(yǎng)的起始濃度為5×10⁵個/mL；

將所述轉染液與所述細胞的懸浮培養(yǎng)液混合的體積比為1:1。

7.根據權利要求1—6中任一所述的方法，其特征在于：

在所述轉染后，將所述細胞經胚狀體誘導培養(yǎng)前，所述細胞的所述靜置懸浮培養(yǎng)的起始濃度為1×10⁵個/mL。

8.根據權利要求1—7中任一所述的方法，其特征在于：所述胚狀體誘導培養(yǎng)按照包括如下步驟的方法進行：將所述細胞于溫度24℃條件下用所述細胞的胚狀體誘導培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)至獲得綠色胚狀體；

所述植株再生培養(yǎng)按照包括如下步驟的方法進行：將所述綠色胚狀體在24℃、每天16小時光照和8小時黑暗、所述光照的強度為6000LUX的條件下用B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至獲得具有根莖葉的所述轉基因植株。

9.根據權利要求1—8中任一所述的方法，其特征在于：

當所述蕓薹屬植物為甘藍型油菜（Brassica?napus?L.）時，所述胚狀體誘導培養(yǎng)基為NLN培養(yǎng)基；

當所述蕓薹屬植物為白菜（Brassica?pekinensis）時，所述胚狀體誘導培養(yǎng)基為添加0.1mg/L6-BA的NLN培養(yǎng)基。

10.根據權利要求1—9中任一所述的方法，其特征在于：所述處于單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞按照包括如下步驟的方法制備：取小孢子發(fā)育至單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物花蕾，用活性氯質量百分含量為4.5%的次氯酸鈉溶液浸泡6分鐘后用無菌水清洗；再將所述花蕾在室溫的B5液體培養(yǎng)基中研碎后用70μm孔徑的濾膜過濾，收集濾液，離心，取沉淀用所述B5液體培養(yǎng)基清洗，獲得所述處于單核靠邊期至雙核早期的蕓薹屬植物游離小孢子細胞。