[發明專利]制備與富集單個微納米珠攜帶單根多聚物分子的方法

有效

• 申請號: 201310101285.3
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103196725A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 王志民;程秀蘭;黃偉東;侯彩玲;王躍;張林霞
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N33/531
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

技術領域

本發明涉及一種生物技術領域的多聚物制備方法，具體是一種制備與富集單個微納米珠攜帶單根多聚物分子的方法。

背景技術

經微納米珠連接單根多聚物（DNA、RNA、蛋白質和肽核酸等）分子進行單分子操縱，可用于檢測多種生命現象的單分子基本行為，包括核酸與核酸、核酸與相關蛋白相互作用動力學、抗體篩選、核酸單分子測序和新一代測序儀的樣品制備等。比較常用的辦法是采用光學鑷和磁鑷操縱連接單分子多聚物的微納米珠，但如何快速和簡便制備這種單個微納米珠連接單根多聚物分子，一直沒有很好解決。

經對現有文獻檢索發現，Dapprich,J.&Nicklaus,N.等在《生物成像》上發表了“通過監控珠子位移將DNA連接到被光學捕獲在微結構的珠子上”一文（Dapprich,J.&Nicklaus,N.DNA?attachment?to?optically?trapped?beads?in?microstructures?monitored?by?bead?displacement.Bioimaging,6:25-32,1998），文中稱他們的研究結果可獲得一個磁珠只連接一根DNA片段，但該方法需要光學鑷，步驟比較繁瑣，效率也較低。因此，本發明要解決的技術問題是提供快速、簡便制備并富集大量的“單個微納米珠攜帶單根多聚物分子”（以下稱“目的復合物”）的方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種快速、簡便制備與富集單個微納米珠攜帶單根多聚物分子的方法，用于在單分子水平研究核酸與相關蛋白分子相互作用動力學、遺傳診斷、抗體篩選、核酸單分子測序和新一代測序儀的樣品制備等。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明提供一種制備與富集單個微納米珠連接單根多聚物分子的方法，該方法在獲得連接單根熒光標記的多聚物分子的單個微納米珠（目的復合物）和空微納米珠的混合物后，采用一內部有溶液通道的流室，該流室溶液通道上游有進樣口和電泳緩沖液填充口；將混合物通過進樣口注入流室，同時將電泳緩沖液通過電泳緩沖液填充口注入流室，流室下端有目的復合物收集口和空微納米珠出口；將連接復合物收集口的目的復合物收集容器連接到電源正極，與目的復合物收集容器對應的流室溶液通道另一處連接到電源負極，利用外加電場，使攜帶凈負電荷目的復合物進入目的復合物收集容器。

本發明方法中，所述獲得連接單根熒光標記的多聚物分子的單個微納米珠（目的復合物）和空微納米珠的混合物，可以采用現有技術制備，也可以按照以下方法制備：

步驟一，在多聚物（包括DNA、RNA、以及二者之一與蛋白質或肽核酸連接后的嵌合體）一端標記一種活性基團，另一端或側鏈標記熒光分子，純化后用連接緩沖液重新溶解；

步驟二，采用可與標記核酸活性基團發生反應的另一種活性基團包被的微納米珠與經步驟一處理過的多聚物混合，通過連接反應將多聚物分子連接到微納米珠上。為使一個微納米珠連接的多聚物分子不超過一根，多聚物分子數目與微納米珠數目的比例按1：≥10混合，結果是一個微納米珠上要么只連接一根多聚物分子，要么不連接多聚物分子，沒有連接一根以上的微納米珠，因微納米珠數目大大超過多聚物分子數，所以，反應后也沒有自由的多聚物分子。

本發明方法中，對于在中性溶液中攜帶負電荷的核酸分子，可直接按上述步驟實施，對蛋白質和肽核酸等多聚物分子，則需要事先連接一段核酸作為電分離的介體，形成多聚物嵌合體。

所述的熒光標記，是可以用于熒光顯微鏡觀察的一類熒光分子。

所述的多聚物分子，是核酸（DNA和RNA）、核酸與蛋白質以及核酸與人工合成的肽核酸多聚物連接后的嵌合體。

所述的微納米珠，是單分子多聚物運載工具，其材質可以是硅、磁性材料或多聚物等，其直徑在納米至微米量級。

所述的標記多聚物分子和包被微納米珠的活性基團，是二者能夠發生免疫綁定、直接或介導形成共價鍵的活性基團對，凡是能夠實現該目的的活性基團對均可，包括但不限于：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗體、氨基-環氧基、氨基-羧基（包括羧基的活化形式如琥珀酰亞胺碳酸酯等）、氨基-羰基、巰基-馬來酰亞胺、巰基-環氧基、巰基-巰基、巰基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。包被微納米珠表面的活性基團可以是中性、酸性或堿性，后兩種情況下，連接產物在分離與富集前，用能使之鈍化的試劑處理微納米珠，使微納米珠表面不攜帶凈電荷。