[發(fā)明專利]人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310100086.0
• 申請(qǐng)日: 2013-03-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104073502A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張巍;唐健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/13
• 分類號(hào): C12N15/13;C12N15/70;C07K16/26;A61K39/395;A61P25/00
• 代理公司: 上海麥其知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是用基因工程方法生產(chǎn)一種能夠快速中和血漿中腦鈉肽成分的基因工程抗體及其制備方法，及其在腦性鹽耗綜合征治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

腦性鹽耗綜合征(cerebral?salt?wasting?syndrome，CSWS)是顱腦疾病常并發(fā)的一種嚴(yán)重危害患者生命健康的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為：低血鈉、高尿鈉和低血容量，其發(fā)病率較高，尤其是在重度顱腦外傷和各種原因所致的蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid?hemorrhage，SAH)患者中發(fā)病率更高。研究表明，CSWS的發(fā)病為中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)分泌腦鈉尿肽(brain?natriuretic?peptide，BNP)影響腎臟對(duì)鈉的重吸收而引起。

血液循環(huán)中的BNP為含32個(gè)氨基酸的多肽，最初從豬腦中分離提取，后來(lái)發(fā)現(xiàn)心臟亦能合成與分泌，而且濃度比腦內(nèi)高。此外它也存在于肺、腎上腺等組織中。BNP有強(qiáng)大的利尿利鈉、擴(kuò)血管、降血壓的作用。在腦組織，BNP主要在下丘腦合成，這部分腦組織受損時(shí)能大量釋放BNP，以緩解顱內(nèi)高壓。過(guò)度分泌的BNP常常導(dǎo)致患者出現(xiàn)低血鈉、高尿鈉和低血容量，危及生命。

CSWS患者的基本治療原則是：補(bǔ)充血容量和保持正鈉平衡。然而補(bǔ)充鈉鹽只能緩解癥狀，并不能減少鈉從腎臟的繼續(xù)丟失，效果往往不佳。部分學(xué)者曾試用鹽皮質(zhì)激素-醋酸氟氫可的松來(lái)治療低鈉血癥，雖然它能增加腎臟對(duì)鈉的從吸收，改善患者癥狀，但這類藥物可引起嚴(yán)重的低血鉀和高血糖癥狀。因此，發(fā)展新的治療途徑來(lái)快速中合血液中的BNP對(duì)于CSWS的治療具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明首次提出了一種能夠快速中和血漿中腦鈉肽成分的基因工程抗體(3C1)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)基因工程技術(shù)制備抗血漿腦鈉肽的基因工程抗體。該新型抗體是完全人源化的，可特異性中和血漿中腦鈉肽，適用于腦性鹽耗綜合征相關(guān)性疾病的治療。人源化是指，抗體基因全部由人類抗體基因所編碼，可大大減少異源抗體對(duì)人類機(jī)體造成的免疫副反應(yīng)。

本發(fā)明提出了一種中和人腦鈉肽的基因工程抗體3C1的制備方法，包括以下步驟：

a)將從噬菌體抗體文庫(kù)淘篩獲得的能特異性識(shí)別腦鈉肽的噬菌體粒基因(3C1)用NocI和NotI雙酶切后插入到pET22b質(zhì)粒，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET22b-3C1；將pET22b-3C1(氨芐青霉素抗性)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS得到基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS。

b)將基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS涂板，挑取單克隆菌至2YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100比例轉(zhuǎn)接后繼續(xù)培養(yǎng)至OD_600nm≈0.4，加1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4個(gè)小時(shí)；離心收集菌體，超聲破菌，獲得包涵體后洗滌、溶解，取上清過(guò)Ni-NTA親和柱，純化產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性處理，獲得高純度、高活性的目的蛋白。

其中，所述步驟b)中2YT培養(yǎng)基的成分為胰蛋白胨1.6g，酵母提取物1g和氯化鈉0.5g溶于1L蒸餾水中。

其中，所述步驟b)中將經(jīng)離心獲得含重組蛋白3C1的菌體先重懸于pH8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中，隨后與100μg/ml溶菌酶混合，于30℃裂解30分鐘，于4℃進(jìn)行超聲破菌，經(jīng)12000r/min離心15min獲得包涵體。

其中，所述步驟b)中洗滌步驟中采用的洗滌液成分為：含2mol/L尿素的50mmol/L?pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化鈉及2％TritonX-100(v/v)，溶解步驟中采用的裂解液成分為：含8mol/L尿素的100mmol/L?pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化鈉，5mmol/Lβ-巰基乙醇及5mmol/L咪唑。

其中，所述復(fù)性處理過(guò)程為：將10mg經(jīng)Ni-NTA親和柱純化得到的變性基因工程抗體3C1逐滴加入到100ml復(fù)性液中，4℃過(guò)夜后，用透析緩沖液及PBS于4℃分別透析12小時(shí)，獲得有活性的重組蛋白3C1；其中，所述復(fù)性液成分為：含2mol/L尿素的100mmol/L?pH8.0Tris-HCl及0.5mol/L?L-精氨酸，所述透析液成分：含20nmol/L氯化鈉的80mmol/L?pH8.0Tris-HCl及0.4mol/L尿素。

其中，所述基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS的脫氧核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。