[發(fā)明專利]人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310100086.0
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN104073502A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設計）人: 張巍;唐健
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/70;C07K16/26;A61K39/395;A61P25/00
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)將特異性識別腦鈉肽的噬菌體粒基因3C1用NocI和NotI雙酶切后插入到pET22b質粒中，構建成重組質粒pET22b-3C1；將所述重組質粒pET22b-3C1轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，得到基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS；

b)將所述基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS涂板，挑取單克隆菌至2YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100比例轉接后繼續(xù)培養(yǎng)至OD_600nm≈0.4，加1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導4個小時；離心收集菌體，超聲破菌，獲得包涵體后洗滌、溶解，取上清過Ni-NTA親和柱，純化產物進行復性處理，獲得重組目的蛋白3C1。

2.根據(jù)權利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中2YT培養(yǎng)基的成分為胰蛋白胨1.6g，酵母提取物1g和氯化鈉0.5g溶于1L蒸餾水中。

3.根據(jù)權利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中將經(jīng)離心獲得含重組蛋白3C1的菌體先重懸于pH8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中，隨后與100μg/ml溶菌酶混合，于30℃裂解30分鐘，于4℃進行超聲破菌，經(jīng)12000r/min離心15min獲得包涵體。

4.根據(jù)權利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中洗滌步驟中采用的洗滌液成分為：含2mol/L尿素的50mmol/L?pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化鈉及2％TritonX-100(v/v)，溶解步驟中采用的裂解液成分為：含8mol/L尿素的100mmol/L?pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化鈉，5mmol/Lβ-巰基乙醇及5mmol/L咪唑。

5.根據(jù)權利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述復性處理過程為：將10mg經(jīng)Ni-NTA親和柱純化得到的變性基因工程抗體3C1逐滴加入到100ml復性液中，4℃過夜后，用透析緩沖液及PBS于4℃分別透析12小時，獲得有活性的重組蛋白3C1；其中，所述復性液成分為：含2mol/L尿素的100mmol/L?pH8.0Tris-HCl及0.5mol/L?L-精氨酸，所述透析液成分：含20nmol/L氯化鈉的80mmol/L?pH8.0Tris-HCl及0.4mol/L尿素。

6.根據(jù)權利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS的脫氧核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

7.根據(jù)權利要求1所述制備方法得到的人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1，其特征在于，3C1基因全長為717bp，對應239個氨基酸，單鏈抗體分子量約為25128.82；等電點預測值為9.28，為堿性蛋白；二級結構預測顯示3C1含45％α螺旋，39％D折疊，5％β轉角；三維結構預測顯示3C1重鏈和輕鏈形成一個疏水口袋，鏈接部游離于此結構之外，符合單鏈抗體的結構特點，具有抗原結合位點的空間構象。

8.根據(jù)權利要求7所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1，其特征在于，所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1具有特異性中和腦鈉肽活性的人源化單抗的體外活性；所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1在間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測中與BNP特異性結合，在直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢測中對BNP多肽具有中和效應，在點雜交法檢測中對BNP檢測靈敏度為10ng。

9.根據(jù)權利要求7所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1在制備治療腦性鹽耗綜合征的藥物中的應用。