[發明專利]一種核酸適配體及其衍生物、核酸適配體的篩選方法及在檢測人膽管癌細胞株中的應用

有效

• 申請號: 201310099114.1
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103205431A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 王柯敏;羊小海;葉玲;郭秋平;譚譽宇;何曉曉
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

技術領域

本發明涉及一種核酸適配體及其篩選和應用，尤其涉及一種可用于檢測人膽管癌細胞的核酸適配體及其篩選方法和應用。

背景技術

核酸適配體（aptamer）是通過指數富集配基的系統進化技術（SELEX）篩選得到的，能特異結合靶物質的單鏈寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA）。核酸適配體與抗體功能類似，但是與抗體相比具有更多的優勢，具有更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠化學合成，成本低；可進行標記；穩定性好，易于保存等優點。核酸適配體的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白質，并從單一靶標擴展至完整的病毒顆粒及細胞等復合物靶標。因此，核酸適配體具有廣泛的應用前景。

人膽管癌細胞株QBC-939屬于肝門部膽管癌（HCCA），肝門部膽管癌是膽道系統常見的惡性腫瘤。肝門部膽管癌因其發生部位特殊、呈浸潤性生長及與肝門部血管關系密切等特點給手術切除造成極大的困難。長期以來，肝門部膽管癌被認為是無法用手術根治性切除的癌腫。近20年來，隨著影像學和手術技術的進步，使肝門部膽管癌的診斷和治療取得重大進展，但肝門部膽管癌有關的發病原因或危險因素尚不清楚，因此篩選出它的aptamer對于臨床檢測、腫瘤標志物的尋找、腫瘤發病機理的發現都有很重要的意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無免疫原性、能夠化學合成、分子量小、穩定、易于保存和標記的可用于檢測人膽管癌細胞株QBC-939的核酸適配體及其衍生物，還相應提供前述核酸適配體的篩選方法和應用。

為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包含以下序列1、序列2中任意一條序列所示的DNA片段：

序列1：

5’-AGAAGGATGGAGAGGAGCACACAATTGGGCGGGGTGTTGACGGGGGAGTTTAAAG

AAGTGGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’；

序列2：

5’-AGAAGGATGGAGAGGAGCACCTAAGCGGGGTTCGAAGTATTCTTATCTTTGCCTGG

ATTGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’。

上述的核酸適配體中，所述核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。

上述的核酸適配體中，所述核酸適配體的核苷酸序列上可結合有生物素、地高辛、熒光物質（如FITC）、納米發光材料或酶標記（甚至連接上放射性和治療性物質等）。

以上不論是經部分取代或者經過修飾后的核苷酸序列，都具有原核酸適配體基本相同或類似的分子結構、理化性質和功能，都可用于檢測人膽管癌細胞株QBC-939。

作為一個總的技術構思，本發明還提供一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種：

（1）與上述所列核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上（例如可將上述核酸適配體序列刪除或增加部分互補的核苷酸）；

（2）與上述所列核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列；?

（3）上述所列核酸適配體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。

作為一個總的技術構思，本發明還提供一種核酸適配體衍生物，所述衍生物是上述所列核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是上述所列核酸適配體改造成的相應肽核酸。

以上不論是衍生出的核酸適配體還是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸適配體基本相同或類似的分子結構性質和功能，即都可用于檢測人膽管癌細胞株QBC-939。

作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟：

（1）合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物：

隨機文庫RS40：5’-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC(40N)GTCCTCGTCTCCTTCCTACT；

5’引物：5’-FAM-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC-3’；

3’引物：5’-Biotin-GTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’；