[發明專利]一種核酸適配體及其衍生物、核酸適配體的篩選方法及在檢測人膽管癌細胞株中的應用

有效

• 申請號: 201310099114.1
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103205431A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 王柯敏;羊小海;葉玲;郭秋平;譚譽宇;何曉曉
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

1.一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包含以下序列1、序列2中任意一條序列所示的DNA片段：

序列1：

5’-AGAAGGATGGAGAGGAGCACACAATTGGGCGGGGTGTTGACGGGGGAGTTTAAAG

AAGTGGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’；

序列2：

5’-AGAAGGATGGAGAGGAGCACCTAAGCGGGGTTCGAAGTATTCTTATCTTTGCCTGG

ATTGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’。

2.根據權利要求1所述的核酸適配體，其特征在于：所述核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。

3.根據權利要求1或2所述的核酸適配體，其特征在于：所述核酸適配體的核苷酸序列上結合有生物素、地高辛、熒光物質、納米發光材料或酶標記。

4.一種核酸適配體，其特征在于：所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種：

（1）與權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上；

（2）與權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列；?

（3）權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。

5.一種核酸適配體衍生物，其特征在于：所述衍生物是權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是權利要求1或2或3中所述核酸適配體改造成的相應肽核酸。

6.一種如權利要求1所述的核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟：

（1）合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物：

隨機文庫RS40：5’-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC(40N)GTCCTCGTCTCCTTCCTACT；

5’引物：5’-FAM-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC-3’；

3’引物：5’-Biotin-GTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’；

（2）Cell-SELEX篩選：培養人膽管癌細胞株QBC-939細胞至基本鋪滿瓶底，去除培養基后用緩沖液洗滌，然后與上述隨機序列在冰上孵育后，棄溶液；再將上述隨機文庫溶解、恒溫振蕩后與經前述處理后的QBC-939細胞在冰上孵育；孵育完成后棄掉孵育瓶內的液體，并用緩沖液沖洗孵育瓶，然后用無菌水刮取孵育瓶內的QBC-939細胞并置于沸水浴中加熱，加熱完成后再離心取上清，即為篩選所得的QBC-939特異核酸適配體文庫；

（3）PCR擴增文庫：將步驟（2）中篩選所得的QBC-939特異核酸適配體文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物；

（4）制備DNA單鏈文庫：將鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球離心去上清，再將步驟（3）中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面，洗滌后加入堿液至瓊脂糖微球中，常溫下反應、離心、收集上清；將上清液過除鹽柱后收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫；

（5）重復篩選：將步驟（4）得到的DNA單鏈文庫替代步驟（2）中的隨機文庫，并重復上述步驟（2）～（4）的過程至少一次；

（6）陰性篩選：培養人肝癌細胞SMMC-7721至基本鋪滿瓶底，去除培基后用緩沖液洗滌，然后與無關序列在冰上孵育后，棄溶液；再將步驟（5）后篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恒溫振蕩后與經前述處理后的人肝癌細胞SMMC-7721在冰上孵育，孵育完成后收集細胞孵育后的溶液；

（7）多輪篩選：將步驟（6）所收集的溶液替代步驟（5）中的DNA單鏈文庫，繼續重復上述步驟（5）～步驟（6）的操作過程至少一次；重復篩選過程中用流式細胞術監測DNA單鏈文庫對QBC-939細胞識別能力的增強情況，直至DNA單鏈文庫對QBC-939細胞的識別能力滿足要求后，將所得產物經克隆測序分析，最終得到核酸適配體。

7.根據權利要求6所述的篩選方法，其特征在于，所述PCR擴增時的工藝條件為：94℃?3min，94℃?30sec，58.5℃?30sec，72℃?30sec，經13輪循環輪數，72℃?3min。