[發明專利]甲型流感病毒疫苗哺乳動物細胞適應株的獲得方法和適應位點

有效

• 申請號: 201310098172.2
• 申請日: 2013-03-25
• 公開（公告）號: CN104073513B
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 孫兵;徐可;胡偉斌;張宏
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N7/01;C07K14/11;C12N9/12;C12N15/44;C12N15/54;C12R1/93
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術和免疫學領域；更具體地，本發明涉及甲型流感病毒疫苗哺乳動物細胞適應株的獲得方法和適應位點。

背景技術

流感是人類歷史上最嚴重的傳染病之一，其主要病原體是流感病毒。流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，根據其內部核蛋白(NP)和基質蛋白(M)的抗原性不同，分為A/B/C(甲/乙/丙)三型。其中，A型(甲型)是致人類和各種動物流感的主型，它的宿主范圍廣泛(包括野生鳥類、家禽、各種哺乳動物以及人類)，變異很快(能夠改變抗原性以逃避宿主免疫系統的攻擊，或者改變自身的藥物靶點特征以獲得抗藥性)。這些特點決定了甲型流感病毒能夠在人畜間廣泛傳播，難以控制。除了每年造成季節性流行(epidemic)，還不定期造成大流行(pandemic)，給人類社會帶來巨大損失。據世界衛生組織(WHO)預測，全球每年平均有1/3的兒童和1/10的成人會感染流感。

甲型流感病毒是一種有包膜的單股負鏈RNA(-ssRNA)病毒，基因組由8條單股負鏈RNA組成，編碼至少10種蛋白質，這10個病毒蛋白包括HA，NA，PA，PB1，PB2，NP，M1，M2，NS1和NS2。其中血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)是主要的表面抗原蛋白，HA主要負責使病毒有效入侵細胞，NA主要負責切斷出芽的新生病毒顆粒與細胞表面的連接使其順利釋放。PA，PB1，PB2組成RNA聚合酶復合體(RdRp)，負責病毒基因組的復制和轉錄。核蛋白(NP)與病毒基因組RNA結合，是構成病毒核糖核蛋白復合體(vRNP)的主要成分。基質蛋白(M1)位于病毒包膜和vRNP之間，負責形成病毒蛋白衣殼。M2形成質子通道，在病毒入侵細胞時，調節內涵體PH值，促進HA的變構和vRNP的釋放。NS1是一個多功能非結構蛋白，在抵抗宿主免疫反應(抗干擾素)等方面有重要作用。NS2又名核轉運蛋白NEP，可引導vRNP出核。

抗擊流感最有效的手段是接種流感疫苗。傳統的流感疫苗采用雞胚生產，技術已經相當成熟，而且所得疫苗安全、有效。但是，雞胚生產疫苗有一些難以克服的缺點，比如：過程繁瑣；需要大量的SPF雞胚，這在流感大流行時難以保證供應；在表面抗原上容易發生突變，可能造成疫苗毒抗原性改變；含有卵清蛋白致敏原等。發展哺乳動物二倍體傳代細胞培養病毒來生產流感疫苗的技術，可以很好的解決以上問題，也是改進流感疫苗生產現狀的重要發展方向。

用于流感病毒疫苗生產研究的細胞系主要有MDCK、Vero、PER.C6等，并已有產品上市。但其中仍有不少問題亟待研究和解決，如：(1)細胞生產疫苗的產量有待提高，包括更加適合在細胞中復制的流感病毒株的開發，更加適宜的細胞培養條件和病毒收獲條件的摸索等；(2)病毒在細胞中傳代的抗原穩定性評價；(3)細胞生產疫苗的安全性評價；(4)其它可用于流感疫苗生產的細胞系開發；等等。

目前流感疫苗的通用骨架毒株是PR8毒株(A/PR/8/34)，它是雞胚適應株，在雞胚中復制效率很高，能使與之重配得到的疫苗毒株獲得在雞胚中的高產特性。但PR8并不適合在哺乳動物細胞中擴增，因此有必要針對哺乳動物細胞生產平臺開發新的骨架毒株，甚至針對每一種不同的培養細胞開發其相應的最適病毒株，以達到最佳的生產效果。因此，本領域需要開發更適應以哺乳動物細胞作為生產細胞的高產疫苗株。

發明內容

本發明的目的在于提供甲型流感病毒疫苗哺乳動物細胞適應株的獲得方法和適應位點

在本發明的第一方面，提供一種制備重組甲型流感病毒株的方法，所述方法包括：

(1)提供病毒拯救系統，其包含流感病毒拯救所需的流感病毒拯救質粒，能完成流感病毒拯救；所述的流感病毒拯救質粒中，

RNA多聚酶PB1的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型RNA多聚酶PB1，氨基酸序列第621位由Q突變為K或者R

RNA多聚酶PA的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型RNA多聚酶PA，氨基酸序列第237位由E突變為K或者R；

核外殼核蛋白NP的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型核外殼核蛋白NP，氨基酸序列第377位由S突變為N；和/或

非結構蛋白NS1的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型非結構蛋白NS1，氨基酸序列第165位由S突變為Y；

(2)將步驟(1)的病毒拯救系統中流感病毒拯救質粒轉染病毒包裝細胞，培養經轉染的病毒包裝細胞，獲得重組流感病毒株，其是哺乳動物細胞適應性的流感病毒株。