[發明專利]甲型流感病毒疫苗哺乳動物細胞適應株的獲得方法和適應位點

有效

• 申請號: 201310098172.2
• 申請日: 2013-03-25
• 公開（公告）號: CN104073513B
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 孫兵;徐可;胡偉斌;張宏
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N7/01;C07K14/11;C12N9/12;C12N15/44;C12N15/54;C12R1/93
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 陳靜

1.一種制備重組甲型流感病毒株的方法，所述方法包括：

(1)提供病毒拯救系統，其包含流感病毒拯救所需的流感病毒拯救質粒，能完成流感病毒拯救；所述的流感病毒拯救質粒中，

RNA多聚酶PB1的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型RNA多聚酶PB1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8中第1-757位且第621位由Q突變為K或者R；

RNA多聚酶PA的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型RNA多聚酶PA，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7中第1-716位且第237位由E突變為K或者R；

核外殼核蛋白NP的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型核外殼核蛋白NP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11中第1-498位且第377位由S突變為N；和

非結構蛋白NS1的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型非結構蛋白NS1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第1-230位且第165位由S突變為Y；

(2)將步驟(1)的病毒拯救系統中流感病毒拯救質粒轉染病毒包裝細胞，培養經轉染的病毒包裝細胞，獲得重組甲型流感病毒株，其是哺乳動物細胞適應性的甲型流感病毒株；所述的病毒包裝細胞選自：Vero細胞，MDCK細胞。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，突變型RNA多聚酶PB1基因以來源于PR8病毒的RNA多聚酶PB1基因進行突變；

突變型RNA多聚酶PA基因以來源于PR8病毒的RNA多聚酶PA基因進行突變；

突變型核外殼核蛋白NP基因以來源于PR8病毒的核外殼核蛋白NP基因進行突變；和

突變型非結構蛋白NS1基因以來源于PR8病毒的非結構蛋白NS1基因進行突變。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的病毒拯救質粒是pHW系列質粒；所述病毒拯救系統包括8個pHW2000質粒，各自獨立地在polI和polII雙重啟動子之間裝載下述8條病毒基因序列：

病毒Segment1，其含有RNA多聚酶PB2編碼基因，藉由雙重啟動子能同時轉錄RNA多聚酶PB2的mRNA及病毒RNA，

病毒Segment2，其含有RNA多聚酶PB1編碼基因，藉由雙重啟動子能同時轉錄RNA多聚酶PB1的mRNA及病毒RNA，

病毒Segment3，其含有RNA多聚酶PA編碼基因，藉由雙重啟動子能同時轉錄RNA多聚酶PA的mRNA及病毒RNA，

病毒Segment4，其含有血凝素HA的編碼基因，藉由雙重啟動子能同時轉錄血凝素HA的mRNA及病毒RNA，

病毒Segment5，其含有核外殼核蛋白NP編碼基因，藉由雙重啟動子能同時轉錄核外殼核蛋白NP的mRNA及病毒RNA，

病毒Segment6，其含有神經酰胺酶NA編碼基因，藉由雙重啟動子能同時轉錄神經酰胺酶NA的mRNA及病毒RNA，

病毒Segment7，其含有基質蛋白M1編碼基因+基質蛋白M2編碼基因，藉由雙重啟動子能同時轉錄基質蛋白的mRNA及病毒RNA，

病毒Segment8，其含有非結構蛋白NS1編碼基因+核轉運蛋白NEP編碼基因，藉由雙重啟動子能同時轉錄NS1和NEP蛋白的mRNA及病毒RNA。

4.一種用于制備重組甲型流感病毒株的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括：病毒拯救系統，其包含甲型流感病毒拯救所需的流感病毒拯救質粒，能實現甲型流感病毒拯救；所述的流感病毒拯救質粒中，

RNA多聚酶PB1的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型RNA多聚酶PB1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8中第1-757位且第621位由Q突變為K或者R；

RNA多聚酶PA的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型RNA多聚酶PA，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7中第1-716位且第237位由E突變為K或者R；

核外殼核蛋白NP的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型核外殼核蛋白NP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11中第1-498位且第377位由S突變為N；

非結構蛋白NS1的編碼基因是突變型基因，其編碼突變型非結構蛋白NS1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第1-230位且第165位由S突變為Y。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括：病毒包裝細胞；所述的病毒包裝細胞選自：Vero細胞，MDCK細胞。

6.權利要求4-5任一所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于制備重組甲型流感病毒株，其是哺乳動物細胞適應性的甲型流感病毒株，所述的哺乳動物細胞選自：Vero細胞，MDCK細胞。