[發明專利]P15發夾構建體及應用

在審

• 申請號: 201310098037.8
• 申請日: 2007-05-02
• 公開（公告）號: CN103224943A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 埃馬紐利·勞伯;于貝爾·吉耶;肯·理查茲;熱拉爾·若納爾;埃洛迪·克萊因;戴維·吉爾默
• 申請（專利權）人: 西斯凡德爾哈維公眾公司
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/63;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 上海市華誠律師事務所 31210
• 代理人: 傅強國;賈師英

本申請是申請日為2007年5月2日、申請號為200780015913.9(PCT/EP2007/054259)的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及發夾DNA構建體，及其用于在植物體內特別是在甜菜植物中誘發轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional?gene?silencing，PTGS)的應用，目的是獲得對濾過性病毒如甜菜壞死黃脈病毒(beet?necrotic?yellow?vein?virus，BNYW)有增強的抗性或耐受性的植物。本發明還涉及對例如甜菜壞死黃脈病毒和其后代有增強的抗性的轉基因細胞和植物。

背景技術

人們對賦予植物以病毒抗性或耐受性這一領域深感興趣。對于農作物，其收成損失很大比例上是由于病毒感染。

一種被稱作叢根病(Rhizomania)的廣泛傳播的甜菜塊根(Beta?vulgaris)疾病是由病毒引起的。該病毒是甜菜壞死黃脈病毒BNYW(1，2)，其借助土傳真菌多粘菌(Polymyxa?betae)被轉移到甜菜的根部(3)。

在甜菜植物供工業使用的歐洲、美國和日本，這種疾病影響面積巨大，而且仍然在向西歐幾個地區擴張(4，5)。

自從1986年以來，大量的報道和出版物描述了使用分離出的在植物體內表達的病毒核苷酸序列來賦予植物以對某種特定感染性病毒的高度的耐受性，或者甚至賦予其以對大量相關病毒的廣譜型抗性(6，7，8)。在大量養殖的種類，如馬鈴薯、南瓜、黃瓜或是西紅柿中，基于基因工程的病毒抗性對策中，記錄最多的對策是使用受控于植物調控元件下的病毒核苷酸序列，用于編碼目標病毒的外殼蛋白(9)。

但是，即使是外殼蛋白介導的抗性中，在轉基因植物體內某一水平的抗性表達可能歸因于不同的機理，如RNA的共抑制作用，或者由于蛋白序列的產生而引發的蛋白質介導的抗性。

總而言之，通過使用農桿菌(Agrobacterium)介導轉化體系或者根據可成功應用于給定物種的組織培養物或細胞培養物的約束條件進行基因直接轉移的方法，從而將病毒序列轉化入適合的植物細胞或組織培養中。(隨后)再生整個植株，并表征轉基因的表達。

甜菜被認為是不適合細胞培養的物種，這限制了該物種中使用實用的基因工程的程度。盡管如此，現在關于對該植物的轉化和再生的報道正在增加(38)。人們已經發表了一些通過在甜菜基因組中轉化和表達BNYW外殼蛋白序列從而使之對BNYW產生耐受性的例子(11，WO91/13159)，雖然他們很少報道關于整個功能性轉基因甜菜植物的數據(12)。其中，報道顯示了有限的數據，這些數據是關于在感染條件下觀測到的被編碼BNYW外殼蛋白序列的基因轉化了的轉基因甜菜植物的實際抗性水平(13，14)。

專利申請WO91/13159描述了一整套技術，包括一種甜菜轉化方法、和在由上述轉化方法得到的轉基因甜菜之中使用BNYW外殼蛋白序列表達作為抗性來源的方法。

基于已經發表的信息，人們仍不能肯定外殼蛋白介導機制為通過完全抑制病毒的繁殖和擴散機制而給予甜菜植物對BNYW感染的完全免疫提供任何潛在可能性。識別一個在感染過程前期能顯著阻礙病毒擴散的抗性機制將是成功開發這樣一個轉基因抗性的主要成果判據。此外，這種抗性將使得可利用的抗性機制多樣化。

因為該疾病在許多國家和地區以一定的速度擴張，其速度取決于各種當地環境和農業因素的共同作用，人們非常關注基因抗性機制的多樣性和改進程度。這些機制，或單獨作用或在共同作用，可能給予供工業使用的現有和將會使用的各種甜菜以一個長期穩定的抗性策略。

BNYW基因組包括五種正義RNA，其中兩種--RNA1和RNA2對于所有植物的感染起著關鍵性的編碼作用，而其它三種(RNA3、RNA4、RNA5)涉及甜菜(甜菜塊根)的載體介導的感染。BNYW在細胞間的移動(cell-to-cell?movement)由位于RNA2上的三種連續的、輕微重疊的病毒基因控制，這套基因被稱作三重基因區段(the?triple?gene?block，TGB)，TGB根序地編碼病毒蛋白P42、P13和P15(通過以千道爾頓(kDa)為單位而算得分子量的指定的基因產物)。