[發明專利]用于制備牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201310097949.3
• 申請日: 2013-03-25
• 公開（公告）號: CN103183728A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發明（設計）人: 巴利民;齊鵬;肖進;栗利芳;宋芳;董春娜;趙洪濤;鄭應華;鄭明舉;張愛民;馬愛榮
• 申請（專利權）人: 中國牧工商（集團）總公司
• 主分類號: C07K14/09
• 分類號: C07K14/09;C07K1/34;C07K1/06;C07K1/04;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 李渤;張偉

1.一種用于制備牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，其特征在于，所述多肽包含如SEQ?ID?NO.?1所示的氨基酸序列。

2.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽還包含具有增強免疫作用的口蹄疫內源或外源性T細胞表位氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列選自SEQ?ID?NO.?2、SEQ?ID?NO.?3和SEQ?ID?NO.?4中的一個或多個；

優選地，所述多肽包含如SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.?6或SEQ?ID?NO.?7所示的氨基酸序列。

3.根據權利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.?6或SEQ?ID?NO.?7所示；

優選地，所述多肽的氨基酸序列中的兩個半胱氨酸的巰基經氧化連接在一起形成二硫鍵；

進一步優選地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應形成共價連接；

更優選地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應形成共價連接。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的多肽的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

（1）以氨基樹脂為起始原料，以由9-芴甲氧羰基保護的氨基酸為單體，按照所述氨基酸序列依次縮合接上氨基酸以合成所述多肽，每步縮合反應后用乙酰咪唑封閉未反應的氨基端；

（2）合成完畢后加入裂解試劑，從而將所述多肽從氨基樹脂上裂解下來；

（3）使用乙醚沉淀所述多肽；和

（4）對所述多肽進行超濾純化，然后進行無菌處理。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1）包括以下步驟：

（1-a）脫保護反應：將氨基樹脂置于體積百分比為15-30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃條件下反應25-40分鐘，從而脫除氨基樹脂上的9-芴甲氧羰基保護基團；

（1-b）洗滌：氮氣吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；

（1-c）縮合反應：加入1-羥基苯丙三唑、二環己基碳二亞胺與由9-芴甲氧羰基保護的氨基酸，然后在20-28℃條件下反應0.5-2.5小時；

（1-d）洗滌：氮氣吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；和

（1-e）封閉反應：加入重量體積百分比為1.5-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液，在20-28℃條件下反應20-40分鐘。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）中裂解試劑的組分為體積比為85：8：6：1的三氟乙酸：三異丙基硅烷：苯酚：H₂O；

優選地，所述步驟（2）的裂解時間為1-4小時。

7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法的步驟（3）中還包括：

（3-a）使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗滌；

（3-b）在加入占反應體系總體積10%的二甲基亞砜情況下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵；和

（3-c）使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應形成共價連接；優選地，在加入占反應體系總體積1%的二異丙基碳二亞胺和0.5%的1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑情況下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者在加入0.1M?H₂SO₄情況下使羧基與羥基之間反應形成共價連接。

8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（4）包括以下步驟：

（4-a）使用切向過濾膜包在20-28℃條件下超濾所述多肽，從而除去小分子雜質；和

（4-b）使用0.2微米在線濾器除菌保存。

9.一種牛口蹄疫O型肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗包含一種或多種根據權利要求1至3中任一項所述的多肽。

10.根據權利要求9所述的肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗還包含佐劑；

優選地，所述佐劑為選自白油、50V、50VII中的一種或多種；

進一步優選地，所述肽疫苗中所包含的多肽和佐劑的體積比為1:1。