[發明專利]一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基及其構建方法

有效

• 申請號: 201310097553.9
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103214563A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 夏海鋒;吳璞強;梁振東;王沙莉;鄭夢杰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/31
• 分類號: C07K14/31;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/10;C12R1/445
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技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基及其構建方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌蛋白A簡稱蛋白A，是金黃色葡萄球菌表面的一種蛋白質，通過共價鍵連接到胞壁肽聚糖。蛋白A分子中存在五個同源性很高的E、D、A、B、C序列，由于能和人及多種哺乳動物IgG的Fc段結合，因此稱之為抗體結合區。蛋白A與抗體的Fc段結合并不影響抗體對抗原的吸附活性，因此被廣泛應用于抗體的親和純化。由于B結構域對抗體的結合力最穩定，而且本身結構也最穩定，因此人們對B序列的研究最多。B序列由3個α螺旋和連接螺旋片段的兩個Loop組成，按照從N端到C端的順序依次是Helix1-Loop1-Helix2-Loop2-Helix3。

以蛋白A為親和配基吸附IgG時結合力很強，需要使用較低pH洗脫液(pH3.0左右)，往往會影響IgG的活性。蛋白A親和層析柱在使用過程中會在柱內殘留核苷酸、變性蛋白質、脂類和微生物等雜質，需要使用在位清洗進行清除，其中NaOH是工業生產中較為廉價和常用的清洗液。天然蛋白A雖然對堿性環境有著較好的耐受性，但是仍然不能滿足長期使用強堿對其進行清洗。盡管天然蛋白A抗體結合區的E、D、A、B、C五個結構域彼此之間有很高的同源性，但是它們對IgG的結合能力存在差異，導致最適洗脫條件不一樣。

因此，本發明針對以上幾點，選取B結構域對天然蛋白A進行分子改造。利用分子生物學方法從核苷酸序列上進行改造和連接，利用大腸桿菌高效表達系統實現高效表達，得到一系列個改造序列串聯組成而且C端添加一個半胱氨酸的重組蛋白A，將得到的重組蛋白A作為親和配基制備親和層析填料，用于抗體的分離純化，具備較溫和洗脫性能和較高的耐堿性能。

發明內容

本發明的目的是提供一種性能改進的重組金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基，用于抗體制備的親和層析填料，具有較好的洗脫性能和耐堿性能。

所述的重組蛋白A親和配基由1到10個Z序列串聯構成的一系列蛋白質。Z序列是B序列經過改造后的產物，與B序列的區別在于在Loop2與Helix3之間添加6個甘氨酸，并將第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分別替換成蘇氨酸和丙氨酸，為了實現蛋白A與填料基質更穩定的連接，在B蛋白序列的C端添加了2個半胱氨酸，從而實現與基質實現雙位點連接。將表達Z序列的基因命名為z，利用同尾酶將1到10個不同數量的z串聯，所表達的重組蛋白A中每兩個Z序列均由兩個絲氨酸相連接。

所述的性能改進的重組蛋白A親和配基的構建方法的步驟為：

(1)引物設計

本發明對蛋白A的B片段進行分子改造，根據重疊PCR和同尾酶連接原理設計引物，將改造后的B片段命名為Z，改造內容為Z(6G)的改造、Z(N23T，F30A)的改造、C端半胱氨酸的添加和1到10個z核苷酸序列的拼接，其中Z(6G)的改造是在B序列第二個Loop后面添加6個甘氨酸增加Loop2長度，從而降低其與抗體的結合力強度，使洗脫更容易進行，Z(N23T，F30A)的改造是對B序列的第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸進行定點突變，分別替換為蘇氨酸和丙氨酸，減少B序列的脫酰胺作用，增強對高濃度堿液的耐受性能，C端半胱氨酸的添加是在B序列的C端添加3個半胱氨酸，以實現重組蛋白A親和配基與瓊脂糖填料基質實現雙位點連接，在引物中添加Nhe?I、Xba?I、Noc?I和BamH?I四個酶切位點，利用同尾酶作用原理將不同個數的z核苷酸序列首尾相連，組成含有不同個數z序列串聯的重組蛋白A表達基因；

(2)重組菌的構建

本發明根據步驟(1)所設計的引物，以金黃色葡萄球菌基因組為模板進行重疊PCR，獲得所需的目的核苷酸序列z，利用T載體pMD18-T構建重組質粒pMD18-T-z₁，轉化感受態E.coli?JM109進行甘油凍管保藏，以此為基礎進行不同個數z序列(z_n)的構建，然后利用Noc?I和BamH?I兩個酶切位點將構建好的z_n序列與表達質粒pET-28a進行酶切連接，得到重組表達質粒pET-28a-z_n，最后轉化感受態E.coli?BL21(DE3)，得到重組蛋白A的表達菌株E.coli?BL21(DE3)/pET-28a-z_n，制備甘油凍管保藏備用；