[發明專利]一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑒定方法

有效

• 申請號: 201310096677.5
• 申請日: 2013-03-25
• 公開（公告）號: CN104073547A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 梁旭方;田昌緒;楊敏;鄭荷子;趙程;竇亞琪;黃威
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于水產養殖魚種及水產動物天然種質資源鑒定技術領域，具體涉及一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，同時還涉及一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類分子的鑒定方法。

背景技術

鱖亞科隸屬鱸形目，自然僅分布于東亞（俄羅斯、日本、韓國、中國和越南（紅河））。鱖亞科中，翹嘴鱖(Siniperca?chuatsi?Basilewsky)、大眼鱖(Siniperca?kneri?Garman)和斑鱖(S?iniperca?scherzeri?Steindachner)為我國主要養殖名貴魚類,它們生活習性基本相同，外形特征相似。以上三種經濟鱖魚在育種過程中，育苗階段無法根據形態學鑒別，尤其翹嘴鱖與大眼鱖即使在魚種和成魚階段，形態學手段亦不易鑒別。中國少鱗鱖(Coreoperca?whiteheadi?Boulenger)和波紋鱖(Siniperca?undulate?Fang&Chong)為鱖亞科中珍稀種類，肉質細嫩、味道鮮美，苗種階段均不易鑒別。

微衛星是由2-6個核苷酸組成的具有高度變異性的簡單重復DNA序列。它分布于真核生物的整個基因組中，具有等位基因數目多、重復性好、呈共顯性遺傳等特點，被廣泛應用于物種鑒定和基因定位等方面的研究。目前除翹嘴鱖與斑鱖外，尚缺乏采用微衛星分子鑒定法進行五種鱖亞科魚類鑒定的相關報道。

發明內容

本發明目的是在于提供了一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，可顯著提高鱖亞科重要經濟、稀有種類間鑒定的效率和準確性，有助于鱖亞科魚類遺傳資源的保護和鱖魚養殖業的持續健康發展。運用本試劑盒，可彌補形態學鑒定的不足，解決了水產養殖中三種常見養殖鱖類（翹嘴鱖、大眼鱖和斑鱖）苗種鑒定的難題，解決了鱖亞科珍稀種類（中國少鱗鱖和波紋鱖）種屬鑒別的問題，從而促進鱖亞科遺傳資源的合理保護和養殖業的健康發展。

本發明的另一個目的是在于提供了一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類分子的鑒定方法，方法易行，操作簡便，鑒定效率高、準確性好。該方法運用微衛星分子標記鑒別鱖亞科主要養殖種類（翹嘴鱖、大眼鱖和斑鱖）及珍稀種類（中國少鱗鱖和波紋鱖），以利于鱖亞科養殖群體的合理管理以及野生資源的保護。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：

一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，它包括三對SSR引物和標準圖譜，其中用于聚合酶鏈式反應的三對引物序列分別為：

引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,

引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;

引物2正向序列：5’TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,

引物2反向序列：5’ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;

引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,

引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;

用于鑒別五種鱖亞科魚類的標準圖譜為：

一種引物1擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜示意圖（圖1）；一種引物2擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜示意圖（圖2）；一種引物3擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜示意圖（圖3）。

一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其步驟是：

1）DNA提?。翰杉郎y鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA并測定其純度和濃度；本步驟中測得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值為1.82-1.97。

2）DNA片段擴增：采用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增待測樣品基因組DNA，擴增引物序列為：

引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,

引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;

引物2正向序列：5’TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,

引物2反向序列：5’ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;

引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,

引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;

本步驟中測得DNA的濃度范圍為585.5-3210.4ng/μl。