[發明專利]一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑒定方法

有效

• 申請號: 201310096677.5
• 申請日: 2013-03-25
• 公開（公告）號: CN104073547A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 梁旭方;田昌緒;楊敏;鄭荷子;趙程;竇亞琪;黃威
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，它包括三對SSR引物和標準圖譜，其中用于聚合酶鏈式反應的三對引物序列分別為：

????引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,

引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;

引物2正向序列：5’?TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,

引物2反向序列：5’?ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;

????引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,

引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;

用于鑒別五種鱖亞科魚類的標準圖譜為：

???????一種引物1擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜；一種引物2擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜；一種引物3擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜。

2.權利要求1所述的一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其步驟是：

????1）DNA提?。翰杉郎y鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA并測定其純度和濃度；測得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值為1.82-1.97；

????2）DNA片段擴增：采用聚合酶鏈式反應擴增待測樣品基因組DNA，擴增引物序列為：

????引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,

????引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;

????引物2正向序列：5’?TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,

????引物2反向序列：5’?ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;

????引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,

????引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;

本步驟中測得DNA的濃度范圍為585.5-3210.4?ng/μl;

PCR反應程序為：94℃預變性4min，然后按以下條件進行35個循環：94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循環結束后72℃延伸10min結束，4℃中保存；

????3）PCR產物的電泳及銀染色鑒定：對PCR產物用非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，常規銀染法染色后，拍照記錄電泳結果；采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠；

4）與標準圖譜進行對比：使用引物1，樣品在靠近標準Marker的300bp位置擴增出1條DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖；使用引物1，在靠近標準Marker的180bp位置擴增出1條特異性條帶，鑒定為斑鱖；使用引物2，樣品在靠近標準Marker的200bp位置擴增出1條或2條DNA條帶，鑒定為波紋鱖；使用引物3，樣品在靠近標準Marker的120bp位置擴增出1條DNA條帶，鑒定為翹嘴鱖；使用引物3，樣品在靠近標準Marker的120bp位置擴增出1條DNA條帶，鑒定為大眼鱖。

3.根據權利要求2所述的一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其特征在于：所述的步驟（3）中PCR反應體系為：

根據權利要求2所述的一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其特征在于：所述的步驟（4）中使用引物1和引物2，待測樣品為五種鱖亞科魚類：翹嘴鱖、大眼鱖、斑鱖、中國少鱗鱖及波紋鱖中的任意一種。

4.根據權利要求2所述的一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其特征在于：所述的步驟（4）中使用引物3時，待測樣品為翹嘴鱖或大眼鱖任意一種。