[發(fā)明專利]一種黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表達方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310095971.4
• 申請日: 2013-03-22
• 公開（公告）號: CN103146726A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳敬;劉旭;吳丹;陳堅
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/81;C12N9/30;C12R1/685;C12R1/84
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 陳圣清

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表達方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)，又稱α-D-葡萄糖苷水解酶，來源廣泛，能催化水解低聚糖類生成葡萄糖，在動物、植物、微生物的糖類代謝中具有重要的生理功能。其中來源于黑曲霉(Aspergillus?niger)的α-葡萄糖苷酶（AGL）不僅具有水解活性，還具有良好的轉(zhuǎn)苷能力，即從麥芽糖的非還原末端切開α-1,4糖苷鍵并將游離出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到其他糖類底物形成α-1,6糖苷鍵，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖（簡稱IMOs，主要包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等)。由于IMOs能夠促進人體內(nèi)益生菌的生長繁殖，具有防齲齒、降低膽固醇等作用，已廣泛應(yīng)用在食品和醫(yī)藥行業(yè)。

P.pastoris表達系統(tǒng)是一種應(yīng)用廣泛的高效表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)，它不僅克服了E.coli等原核表達系統(tǒng)不能表達結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)、易形成不溶性包涵體等缺陷，而且彌補了昆蟲細胞及哺乳類細胞等真核表達系統(tǒng)操作復(fù)雜、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本昂貴的不足。目前提高外源蛋白在P.pastoris中表達量主要有增加目的基因拷貝數(shù)，選擇強啟動子，密碼子優(yōu)化，共表達分子伴侶以及發(fā)酵優(yōu)化等策略。

發(fā)明人前期的研究中以A.niger?CICIM?F0620總RNA為模板，通過RT-PCR獲得α-葡萄糖苷酶cDNA，并在P.pastoris?KM71中表達，3L罐表達量為3.51U/mL，較野生型及其它基因工程菌有明顯提高，但表達水平仍不足以滿足生產(chǎn)需求。因此，進一步提高該酶的表達量對工業(yè)化生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶是相對有利的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種黑曲霉α葡萄糖苷酶基因，用畢赤酵母偏愛密碼子替代稀有密碼子，共改變了728個堿基，涉及222個密碼子，GC含量由50.0%下降到44.2％。

具體而言，以NCBI數(shù)據(jù)庫中A.niger?CBS513.88的α-葡萄糖苷酶序列(NCBI登錄號：4991096)為基礎(chǔ)根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性對原始基因進行了密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后基因aglu^OP核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。優(yōu)化后基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母KM71菌中在3L罐上甲醇誘導(dǎo)110h后酶活達力到8.2U/mL，是密碼子優(yōu)化前的2.3倍。

本發(fā)明還提供一種表達優(yōu)化后aglu^OP基因的方法，通過共表達二硫鍵異構(gòu)酶PDI改善酵母細胞內(nèi)的折疊環(huán)境，實現(xiàn)黑曲霉α-葡萄糖苷酶的高效表達。

所述優(yōu)化后基因aglu^OP人工合成后與畢赤酵母表達載體pPIC9K連接，酶切鑒定和序列測定獲得了重組表達質(zhì)粒pPIC9K-aglu^OP并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母KM71菌中。

pPICZA-pdi重組載體含有二硫鍵異構(gòu)酶PDI基因，為本實驗前期構(gòu)建，詳見Zhang?J,Wu?D,Chen?J,Wu?J(2011)Enhancing?functional?expression?ofβ-glucosidase?in?Pichia?pastoris?by?co-expressing?protein?disulfide?isomerase.Biotechnology?and?Bioprocess?Engineering16(6):1196-1200。

采用二硫鍵異構(gòu)酶與aglu^OP基因共表達的方法，在3L罐上甲醇誘導(dǎo)110h后酶活達力到10.1U/mL，是共表達前的1.2倍，為α-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

有益效果：本發(fā)明公開了一種密碼子優(yōu)化后的黑曲霉α-葡萄糖苷酶及其在畢赤酵母中的高效表達方法。所述基因構(gòu)建到畢赤酵母表達載體并與二硫鍵異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中共表達，在3L罐上誘導(dǎo)110h后酶活達力可到10.1U/mL，是優(yōu)化前的2.9倍，可用于α-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1菌落PCR核酸電泳圖（M1為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，1代表pdi基因）

圖2為本發(fā)明優(yōu)化的aglu^OP基因的SDS-PAGE分析，其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為表達的黑曲霉α葡萄糖苷酶蛋白

圖3為本發(fā)明優(yōu)化的aglu^OP基因與PDI在3L罐共表達的發(fā)酵酶活曲線

具體實施方式