[發明專利]稻谷內源性酶激活法生產高GABA功能食品材料的方法

有效

• 申請號: 201310095563.9
• 申請日: 2013-03-25
• 公開（公告）號: CN103181523A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發明（設計）人: 王立峰;陳靜宜
• 申請（專利權）人: 南京財經大學;王立峰
• 主分類號: A23L1/105
• 分類號: A23L1/105;A23L1/185;A23L1/29;C12N9/88
• 代理公司: 南通市永通專利事務所 32100
• 代理人: 葛雷

1.一種稻谷內源性酶激活法生產高GABA功能食品材料的方法，其特征是：

（1）在明確稻米內源性谷氨酸脫羧酶特性和活性調節機制的基礎上，采用谷氨酸脫羧酶激活技術，生產高GABA含量的稻米健康食品；

（2）以富含GABA的發芽糙米為原料，采用鈍化分解GABA的轉氨酶預處理，生產留胚GABA精白米；

（3）采用含有谷氨酸脫羧酶激活劑和特殊緩沖體系的天然培養液進行發芽；?

（4）以米糠、米胚芽作為GAD源，將其固定化后生產富集GABA的食品配料，并將其應用到GABA營養配合米粉生產中。

2.一種稻谷內源性谷氨酸脫羧酶的制備方法，其特征是：包括下列步驟：

（1）γ-氨基丁酸的制備：稱取糙米置于盤中，先用自來水沖洗一遍，洗去表面的雜質和灰塵，再加入4倍體積的水浸泡，將浸泡后的糙米均勻地攤于盤中，加入水，蓋上濕潤的紗布，發芽；然后稱取發芽糙米，加入水磨成漿狀，制成糙米漿；取一定量的糙米漿，在其中加入底物L-谷氨酸、輔酶PLP及激活劑CaCl_2?，在PBS緩沖液中轉化生成GABA；

（2）谷氨酸脫羧酶提?。悍Q取發芽糙米，加入由磷酸緩沖液、維生素B₆、?EDTA、β-巰基乙醇及NaCL組成的提取緩沖液研磨勻漿，靜置提取后離心，上清液即為谷氨酸脫羧酶提取液；

（3）谷氨酸脫羧酶分離純化：谷氨酸脫羧酶提取液中加入(NH₄)₂SO₄至?30%飽和度，靜置，冷凍離心去除部分雜蛋白；上清液加入(NH₄)₂SO₄至?50%飽和度，靜置，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀，沉淀溶于標準緩沖液；在標準緩沖液中透析至無?NH₄⁺，得到?GAD?粗酶液，冷凍干燥保存；采用?DEAE-Sephrose?FF?陰離子交換柱對米胚?GAD?進行分離，控制米胚?GAD?的等電點在?4.5~4.7，分離采用磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫；再取經上述處理得到的米胚?GAD上Superdex?200?凝膠柱，用磷酸鉀緩沖液反復洗脫，即得分離純化后的谷氨酸脫羧酶。

3.?根據權利要求2所述的稻谷內源性谷氨酸脫羧酶的制備方法，其特征是：包括下列步驟：

(1)γ-氨基丁酸制備：稱取200g的糙米置于盤中，先用自來水沖洗一遍，洗去表面的雜質和灰塵，再加入4倍體積的水于40℃下浸泡12h；將浸泡后的糙米均勻地攤于鋪有四層紗布的盤中，加入水,蓋上濕潤的紗布，置于35℃下發芽72h，得發芽糙米；稱取50g發芽糙米，加入200mL水用高速組織搗碎機磨成漿狀，得糙米漿；取一定量的糙米漿，在其中加入9.5mmol/L底物谷氨酸鈉、輔酶PLP、?0.2mmol/L激活劑CaCl_2?，在pH為6.5的PBS緩沖液中轉化生成GABA，控制轉化溫度為40.0℃；

（2）谷氨酸脫羧酶提?。悍Q取100g的發芽糙米，加入50mmol/L?pH5.7磷酸緩沖液，0.5mmol/L維生素B₆，2mmol/L?EDTA，0.2%的β-巰基乙醇，0.15mol/L?NaCL的提取緩沖液研磨勻漿，定容至1000mL，靜置提取2h后離心10min，上清液即為GAD?提取液；

（3）谷氨酸脫羧酶分離純化：GAD提取液中加入(NH₄)₂SO₄至?30%飽和度，4℃靜置?1h，冷凍離心去除部分雜蛋白，上清液加入(NH₄)₂SO₄至?50%飽和度，4℃靜置?1h，冷凍離心棄去上清液，收集沉淀，沉淀溶于標準緩沖液，在標準緩沖液中透析至無?NH₄⁺，得到?GAD?粗酶液，冷凍干燥保存；采用?DEAE-Sephrose?FF?陰離子交換柱對米胚?GAD?進行分離，控制米胚?GAD?的等電點在4.7?；分離采用?50mmol/L、pH5.6、1.30mol/L?NaCl?濃度的磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫；再取一定量經上述離子交換色譜分離并透析除鹽的米胚?GAD上Superdex?200?凝膠柱，用?pH5.6，含?1mmol/L?PLP?和?1mmol/L?PMSF?的?50mmol/L?磷酸鉀緩沖液反復洗脫，即得分離純化后的GAD。