[發(fā)明專利]一種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置和方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310094976.5
• 申請日: 2013-03-22
• 公開（公告）號: CN103163194A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 包建民;李優(yōu)鑫;張勃;高赫男
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N1/28
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 李麗萍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離和檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)，尤其涉及一種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置和方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是藥物靶點發(fā)掘的一個重要方法。通過比較健康狀態(tài)/疾病狀態(tài)，經(jīng)藥處理/未經(jīng)處理條件下，細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)表達(dá)譜圖的差異，并分離出表達(dá)異常的蛋白質(zhì)加以鑒定，從而找出與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)和藥物治療的可能靶點。二維凝膠電泳（2-DE）和質(zhì)譜（MS）聯(lián)合應(yīng)用是蛋白質(zhì)組學(xué)中分離鑒別蛋白質(zhì)的最常用方法。2-DE可以實現(xiàn)數(shù)千種蛋白質(zhì)的同時分離，并通過染色得到蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜。MS可以精確測定由蛋白酶（通常為胰蛋白酶）水解得到的多肽片斷的質(zhì)量，通過肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定每一個蛋白質(zhì)。

經(jīng)二維凝膠分離后在進行染色方能跟蹤蛋白質(zhì)的分離情況。常用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、硝酸銀染色（銀染）、熒光標(biāo)記染色、負(fù)染等，這些方法的靈敏度和特點各不相同，其中考馬斯亮藍(lán)染色（coomassie?brilliant?blue,CBB）和銀染最為常用?？捡R斯亮藍(lán)染色的原理是CBB分子上的芳香苯環(huán)與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合，以及其亞硫酸基團（-SO₃^-）與蛋白質(zhì)的正電荷結(jié)合，將蛋白質(zhì)染成藍(lán)色條帶。CBB有G250和R250兩種，G250為二甲花青亮藍(lán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)迅速，兩分鐘左右即可達(dá)到平衡，染色后為藍(lán)綠色，常用來測定蛋白質(zhì)含量，也可用來對電泳條帶染色，但是染色后背景較深不易脫色。R250為三苯基甲烷，結(jié)構(gòu)上比G250少兩個甲基，染色后為紅藍(lán)色，R250與蛋白質(zhì)反應(yīng)速度較慢，但染料可以穿透凝膠，而且可以被洗脫下去，因此可用來對電泳條帶進行染色。考馬斯亮藍(lán)染色方法簡單，無毒性，染色后背景及對比度良好，但是靈敏度較低，對于表達(dá)豐度低的蛋白質(zhì)，難以顯色。銀染是一種靈敏度非常高的染色方法，是差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的顯色方式。原理是銀離子與蛋白質(zhì)分子上的羧基（-COO^-）結(jié)合生成穩(wěn)定的復(fù)合物，銀離子經(jīng)甲醛還原后成為金屬銀，銀顆粒沉積在蛋白質(zhì)上，使蛋白條帶呈深棕至黑色。銀染的優(yōu)點在于靈敏度高,但是操作較為繁瑣，染色時間長，接觸有毒試劑甲醛，核酸、脂多糖、脂類等化合物易引起干擾，參見：Miller?I,Crawford?J,Gianazza?E,Protein?stains?for?proteomic?applications:which,when,why？J?Proteomics,2006,6:5385～5408。

以電噴霧電離（electrospray?ionization,ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix-assisted?laser?desoption/ionization,MALDI）兩項軟電離技術(shù)為基礎(chǔ)的生物質(zhì)譜，具有自動化程度高、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點，能夠準(zhǔn)確測定多肽和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、氨基酸的序列及翻譯后修飾。生物質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)使得蛋白質(zhì)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測成為可能，無可爭議的成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)，推動著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展。

2-DE（二維凝膠電泳）和MS（質(zhì)譜）是目前最流行、最可靠的蛋白質(zhì)分析平臺，但是蛋白質(zhì)從二維凝膠到質(zhì)譜的樣品處理過程卻非常的繁瑣，難以對膠中所分離的蛋白進行后續(xù)的氨基酸組成和序列分析、質(zhì)譜測定等結(jié)構(gòu)鑒定工作或在線定性定量分析。聚丙烯酰胺凝膠是由單體和交聯(lián)劑發(fā)生聚合反應(yīng)生成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由于遭受到物理障礙，以及固定和染色的影響，生物高聚物（蛋白質(zhì)，核酸等）從凝膠中轉(zhuǎn)移較為困難，只有采用強烈的手段才能使包埋于凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)取出來。目前報道的可以轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)方法包括直接洗脫、電洗脫、膜轉(zhuǎn)印等，具有耗時長、操作繁瑣、重復(fù)性差、容易造成樣品損失和分析物稀釋等缺點，難以滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究的自動化需要。