[發(fā)明專利]一種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置和方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310094976.5 | 申請日: | 2013-03-22 |
| 公開(公告)號: | CN103163194A | 公開(公告)日: | 2013-06-19 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人: | 包建民;李優(yōu)鑫;張勃;高赫男 | 申請(專利權(quán))人: | 天津大學(xué) |
| 主分類號: | G01N27/26 | 分類號: | G01N27/26;G01N1/28 |
| 代理公司: | 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201 | 代理人: | 李麗萍 |
| 地址: | 300072*** | 國省代碼: | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書: | 查看更多 | 說明書: | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 在線 轉(zhuǎn)移 分析 凝膠 蛋白質(zhì) 裝置 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種分離和檢測蛋白質(zhì)的技術(shù),尤其涉及一種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置和方法。
背景技術(shù)
蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是藥物靶點發(fā)掘的一個重要方法。通過比較健康狀態(tài)/疾病狀態(tài),經(jīng)藥處理/未經(jīng)處理條件下,細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)表達(dá)譜圖的差異,并分離出表達(dá)異常的蛋白質(zhì)加以鑒定,從而找出與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)和藥物治療的可能靶點。二維凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜(MS)聯(lián)合應(yīng)用是蛋白質(zhì)組學(xué)中分離鑒別蛋白質(zhì)的最常用方法。2-DE可以實現(xiàn)數(shù)千種蛋白質(zhì)的同時分離,并通過染色得到蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜。MS可以精確測定由蛋白酶(通常為胰蛋白酶)水解得到的多肽片斷的質(zhì)量,通過肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定每一個蛋白質(zhì)。
經(jīng)二維凝膠分離后在進行染色方能跟蹤蛋白質(zhì)的分離情況。常用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、硝酸銀染色(銀染)、熒光標(biāo)記染色、負(fù)染等,這些方法的靈敏度和特點各不相同,其中考馬斯亮藍(lán)染色(coomassie?brilliant?blue,CBB)和銀染最為常用??捡R斯亮藍(lán)染色的原理是CBB分子上的芳香苯環(huán)與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合,以及其亞硫酸基團(-SO3-)與蛋白質(zhì)的正電荷結(jié)合,將蛋白質(zhì)染成藍(lán)色條帶。CBB有G250和R250兩種,G250為二甲花青亮藍(lán),與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)迅速,兩分鐘左右即可達(dá)到平衡,染色后為藍(lán)綠色,常用來測定蛋白質(zhì)含量,也可用來對電泳條帶染色,但是染色后背景較深不易脫色。R250為三苯基甲烷,結(jié)構(gòu)上比G250少兩個甲基,染色后為紅藍(lán)色,R250與蛋白質(zhì)反應(yīng)速度較慢,但染料可以穿透凝膠,而且可以被洗脫下去,因此可用來對電泳條帶進行染色。考馬斯亮藍(lán)染色方法簡單,無毒性,染色后背景及對比度良好,但是靈敏度較低,對于表達(dá)豐度低的蛋白質(zhì),難以顯色。銀染是一種靈敏度非常高的染色方法,是差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的顯色方式。原理是銀離子與蛋白質(zhì)分子上的羧基(-COO-)結(jié)合生成穩(wěn)定的復(fù)合物,銀離子經(jīng)甲醛還原后成為金屬銀,銀顆粒沉積在蛋白質(zhì)上,使蛋白條帶呈深棕至黑色。銀染的優(yōu)點在于靈敏度高,但是操作較為繁瑣,染色時間長,接觸有毒試劑甲醛,核酸、脂多糖、脂類等化合物易引起干擾,參見:Miller?I,Crawford?J,Gianazza?E,Protein?stains?for?proteomic?applications:which,when,why?J?Proteomics,2006,6:5385~5408。
以電噴霧電離(electrospray?ionization,ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix-assisted?laser?desoption/ionization,MALDI)兩項軟電離技術(shù)為基礎(chǔ)的生物質(zhì)譜,具有自動化程度高、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點,能夠準(zhǔn)確測定多肽和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、氨基酸的序列及翻譯后修飾。生物質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)使得蛋白質(zhì)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測成為可能,無可爭議的成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù),推動著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展。
2-DE(二維凝膠電泳)和MS(質(zhì)譜)是目前最流行、最可靠的蛋白質(zhì)分析平臺,但是蛋白質(zhì)從二維凝膠到質(zhì)譜的樣品處理過程卻非常的繁瑣,難以對膠中所分離的蛋白進行后續(xù)的氨基酸組成和序列分析、質(zhì)譜測定等結(jié)構(gòu)鑒定工作或在線定性定量分析。聚丙烯酰胺凝膠是由單體和交聯(lián)劑發(fā)生聚合反應(yīng)生成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),由于遭受到物理障礙,以及固定和染色的影響,生物高聚物(蛋白質(zhì),核酸等)從凝膠中轉(zhuǎn)移較為困難,只有采用強烈的手段才能使包埋于凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)取出來。目前報道的可以轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)方法包括直接洗脫、電洗脫、膜轉(zhuǎn)印等,具有耗時長、操作繁瑣、重復(fù)性差、容易造成樣品損失和分析物稀釋等缺點,難以滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究的自動化需要。
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