[發明專利]一種在線轉移和分析凝膠中蛋白質的裝置和方法無效
| 申請號: | 201310094976.5 | 申請日: | 2013-03-22 |
| 公開(公告)號: | CN103163194A | 公開(公告)日: | 2013-06-19 |
| 發明(設計)人: | 包建民;李優鑫;張勃;高赫男 | 申請(專利權)人: | 天津大學 |
| 主分類號: | G01N27/26 | 分類號: | G01N27/26;G01N1/28 |
| 代理公司: | 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201 | 代理人: | 李麗萍 |
| 地址: | 300072*** | 國省代碼: | 天津;12 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 在線 轉移 分析 凝膠 蛋白質 裝置 方法 | ||
技術領域
本發明涉及一種分離和檢測蛋白質的技術,尤其涉及一種在線轉移和分析凝膠中蛋白質的裝置和方法。
背景技術
蛋白質組學技術是藥物靶點發掘的一個重要方法。通過比較健康狀態/疾病狀態,經藥處理/未經處理條件下,細胞、組織或生物體蛋白質表達譜圖的差異,并分離出表達異常的蛋白質加以鑒定,從而找出與疾病相關的蛋白質和藥物治療的可能靶點。二維凝膠電泳(2-DE)和質譜(MS)聯合應用是蛋白質組學中分離鑒別蛋白質的最常用方法。2-DE可以實現數千種蛋白質的同時分離,并通過染色得到蛋白質的表達圖譜。MS可以精確測定由蛋白酶(通常為胰蛋白酶)水解得到的多肽片斷的質量,通過肽質量指紋圖譜鑒定每一個蛋白質。
經二維凝膠分離后在進行染色方能跟蹤蛋白質的分離情況。常用的染色方法有考馬斯亮藍染色、硝酸銀染色(銀染)、熒光標記染色、負染等,這些方法的靈敏度和特點各不相同,其中考馬斯亮藍染色(coomassie?brilliant?blue,CBB)和銀染最為常用。考馬斯亮藍染色的原理是CBB分子上的芳香苯環與蛋白質的疏水區結合,以及其亞硫酸基團(-SO3-)與蛋白質的正電荷結合,將蛋白質染成藍色條帶。CBB有G250和R250兩種,G250為二甲花青亮藍,與蛋白質結合反應迅速,兩分鐘左右即可達到平衡,染色后為藍綠色,常用來測定蛋白質含量,也可用來對電泳條帶染色,但是染色后背景較深不易脫色。R250為三苯基甲烷,結構上比G250少兩個甲基,染色后為紅藍色,R250與蛋白質反應速度較慢,但染料可以穿透凝膠,而且可以被洗脫下去,因此可用來對電泳條帶進行染色。考馬斯亮藍染色方法簡單,無毒性,染色后背景及對比度良好,但是靈敏度較低,對于表達豐度低的蛋白質,難以顯色。銀染是一種靈敏度非常高的染色方法,是差異蛋白質組學研究中最常用的顯色方式。原理是銀離子與蛋白質分子上的羧基(-COO-)結合生成穩定的復合物,銀離子經甲醛還原后成為金屬銀,銀顆粒沉積在蛋白質上,使蛋白條帶呈深棕至黑色。銀染的優點在于靈敏度高,但是操作較為繁瑣,染色時間長,接觸有毒試劑甲醛,核酸、脂多糖、脂類等化合物易引起干擾,參見:Miller?I,Crawford?J,Gianazza?E,Protein?stains?for?proteomic?applications:which,when,why?J?Proteomics,2006,6:5385~5408。
以電噴霧電離(electrospray?ionization,ESI)和基質輔助激光解吸電離(matrix-assisted?laser?desoption/ionization,MALDI)兩項軟電離技術為基礎的生物質譜,具有自動化程度高、靈敏度高、準確性好的特點,能夠準確測定多肽和蛋白質的相對分子質量、氨基酸的序列及翻譯后修飾。生物質譜技術的出現使得蛋白質快速、準確、高通量的檢測成為可能,無可爭議的成為蛋白質組學研究的核心技術,推動著蛋白質組學的快速發展。
2-DE(二維凝膠電泳)和MS(質譜)是目前最流行、最可靠的蛋白質分析平臺,但是蛋白質從二維凝膠到質譜的樣品處理過程卻非常的繁瑣,難以對膠中所分離的蛋白進行后續的氨基酸組成和序列分析、質譜測定等結構鑒定工作或在線定性定量分析。聚丙烯酰胺凝膠是由單體和交聯劑發生聚合反應生成的網狀結構,由于遭受到物理障礙,以及固定和染色的影響,生物高聚物(蛋白質,核酸等)從凝膠中轉移較為困難,只有采用強烈的手段才能使包埋于凝膠內的蛋白質取出來。目前報道的可以轉移凝膠中蛋白質方法包括直接洗脫、電洗脫、膜轉印等,具有耗時長、操作繁瑣、重復性差、容易造成樣品損失和分析物稀釋等缺點,難以滿足蛋白質組學研究的自動化需要。
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