[發明專利]一種在線轉移和分析凝膠中蛋白質的裝置和方法

無效

• 申請號: 201310094976.5
• 申請日: 2013-03-22
• 公開（公告）號: CN103163194A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 包建民;李優鑫;張勃;高赫男
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N1/28
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 李麗萍

技術領域

本發明涉及一種分離和檢測蛋白質的技術，尤其涉及一種在線轉移和分析凝膠中蛋白質的裝置和方法。

背景技術

蛋白質組學技術是藥物靶點發掘的一個重要方法。通過比較健康狀態/疾病狀態，經藥處理/未經處理條件下，細胞、組織或生物體蛋白質表達譜圖的差異，并分離出表達異常的蛋白質加以鑒定，從而找出與疾病相關的蛋白質和藥物治療的可能靶點。二維凝膠電泳（2-DE）和質譜（MS）聯合應用是蛋白質組學中分離鑒別蛋白質的最常用方法。2-DE可以實現數千種蛋白質的同時分離，并通過染色得到蛋白質的表達圖譜。MS可以精確測定由蛋白酶（通常為胰蛋白酶）水解得到的多肽片斷的質量，通過肽質量指紋圖譜鑒定每一個蛋白質。

經二維凝膠分離后在進行染色方能跟蹤蛋白質的分離情況。常用的染色方法有考馬斯亮藍染色、硝酸銀染色（銀染）、熒光標記染色、負染等，這些方法的靈敏度和特點各不相同，其中考馬斯亮藍染色（coomassie?brilliant?blue,CBB）和銀染最為常用。考馬斯亮藍染色的原理是CBB分子上的芳香苯環與蛋白質的疏水區結合，以及其亞硫酸基團（-SO₃^-）與蛋白質的正電荷結合，將蛋白質染成藍色條帶。CBB有G250和R250兩種，G250為二甲花青亮藍，與蛋白質結合反應迅速，兩分鐘左右即可達到平衡，染色后為藍綠色，常用來測定蛋白質含量，也可用來對電泳條帶染色，但是染色后背景較深不易脫色。R250為三苯基甲烷，結構上比G250少兩個甲基，染色后為紅藍色，R250與蛋白質反應速度較慢，但染料可以穿透凝膠，而且可以被洗脫下去，因此可用來對電泳條帶進行染色。考馬斯亮藍染色方法簡單，無毒性，染色后背景及對比度良好，但是靈敏度較低，對于表達豐度低的蛋白質，難以顯色。銀染是一種靈敏度非常高的染色方法，是差異蛋白質組學研究中最常用的顯色方式。原理是銀離子與蛋白質分子上的羧基（-COO^-）結合生成穩定的復合物，銀離子經甲醛還原后成為金屬銀，銀顆粒沉積在蛋白質上，使蛋白條帶呈深棕至黑色。銀染的優點在于靈敏度高,但是操作較為繁瑣，染色時間長，接觸有毒試劑甲醛，核酸、脂多糖、脂類等化合物易引起干擾，參見：Miller?I,Crawford?J,Gianazza?E,Protein?stains?for?proteomic?applications:which,when,why？J?Proteomics,2006,6:5385～5408。

以電噴霧電離（electrospray?ionization,ESI）和基質輔助激光解吸電離（matrix-assisted?laser?desoption/ionization,MALDI）兩項軟電離技術為基礎的生物質譜，具有自動化程度高、靈敏度高、準確性好的特點，能夠準確測定多肽和蛋白質的相對分子質量、氨基酸的序列及翻譯后修飾。生物質譜技術的出現使得蛋白質快速、準確、高通量的檢測成為可能，無可爭議的成為蛋白質組學研究的核心技術，推動著蛋白質組學的快速發展。

2-DE（二維凝膠電泳）和MS（質譜）是目前最流行、最可靠的蛋白質分析平臺，但是蛋白質從二維凝膠到質譜的樣品處理過程卻非常的繁瑣，難以對膠中所分離的蛋白進行后續的氨基酸組成和序列分析、質譜測定等結構鑒定工作或在線定性定量分析。聚丙烯酰胺凝膠是由單體和交聯劑發生聚合反應生成的網狀結構，由于遭受到物理障礙，以及固定和染色的影響，生物高聚物（蛋白質，核酸等）從凝膠中轉移較為困難，只有采用強烈的手段才能使包埋于凝膠內的蛋白質取出來。目前報道的可以轉移凝膠中蛋白質方法包括直接洗脫、電洗脫、膜轉印等，具有耗時長、操作繁瑣、重復性差、容易造成樣品損失和分析物稀釋等缺點，難以滿足蛋白質組學研究的自動化需要。