[發(fā)明專利]一種多片段DNA分子組裝方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310094572.6
• 申請(qǐng)日: 2013-03-22
• 公開（公告）號(hào): CN103215296A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李陽;李陽生;盧楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子克隆技術(shù)，合成生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種多片段DNA分子組裝方法及應(yīng)用。?

背景技術(shù)

目前，雖然有各種適合長片段擴(kuò)增DNA聚合酶，但是在基因組大片段克隆上仍然存在不足，首先大片段擴(kuò)增的能力有限10kb左右，其次長片段的突變率會(huì)隨之增加，但是對(duì)于一個(gè)完整大片段的測(cè)序和回復(fù)突變都是需要很長的時(shí)間和花費(fèi)很大的精力。對(duì)于全基因合成技術(shù)，是通過不對(duì)稱PCR技術(shù)合成初期的PCR片段，但是此PCR片段不可能一次合成很長。所以要通過一定的拼接策略，往往要多輪PCR，但是這樣又會(huì)帶進(jìn)去較多的突變。同時(shí)單純的使用PCR合成的長度非常有限，往往1kb左右，目前銷售的clone?eazy系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)分段克隆，所以一些擁有此專利的公司能夠?qū)崿F(xiàn)較長DNA片段的合成，但是此系統(tǒng)需要分段測(cè)序，合成速度較慢。在多基因載體構(gòu)建方面，隨著生物學(xué)研究的深入，將突破單個(gè)基因研究進(jìn)行多基因相互協(xié)調(diào)的研究，單個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化將不能勝任。所以將多個(gè)基因構(gòu)建在同一個(gè)載體上并且進(jìn)行一次性轉(zhuǎn)化的技術(shù)將非常必要，目前雖然有一些多基因組裝系統(tǒng)，但是操作相對(duì)復(fù)雜。每個(gè)基因加入需要多步的操作，而且不能實(shí)現(xiàn)無縫連接。?

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種多片段DNA分子組裝方法及應(yīng)用。主要提供一套適合于多個(gè)DNA片段無縫組裝成一個(gè)完整大片段的方法及其在基因片段合成、含有多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建，合成生物學(xué)等方面的應(yīng)用。?

技術(shù)方案：針對(duì)目前DNA分子組裝方法存在的問題和缺陷，本發(fā)明的一種多片段DNA分子組裝方法，包括以下步驟：?

1）載體系統(tǒng)構(gòu)建：該系統(tǒng)由接受載體A1、供給載體B1和/或供給載體B2組成的系統(tǒng)，?

所述接受載體A1含有一組內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，且按照：“載體骨架---反向內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基----正向內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)----載體骨架”排列，且載體骨架中不含有此內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)；?

所述供給載體B1的多克隆位點(diǎn)中含有三組內(nèi)切酶位點(diǎn)，且按照多克隆位點(diǎn)序列左側(cè)待添加目標(biāo)序列L_m的順序排列：“載體骨架---正向奇數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)--反向克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基---正向克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)--反向偶數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基----正向偶數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---反向奇數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---載體骨架”，或者多克隆位點(diǎn)序列右側(cè)添加目標(biāo)序列R_n的順序排列：“載體骨架---正向奇數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---反向偶數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基---正向偶數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)--反向克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基---正向克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---反向奇數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---載體骨架”排列，且此供給載體B1的載體骨架中含有的克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)被全部剔除，其中m=1，3，5，7……等奇數(shù)，n=2，4，6，8……等偶數(shù)；?

所述供給載體B2的多克隆位點(diǎn)中含有三組內(nèi)切酶位點(diǎn)，且按照多克隆位點(diǎn)序列左側(cè)待添加目標(biāo)序列L_m的順序排列：“載體骨架---正向偶數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)--反向克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基---正向克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)--反向奇數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基----正向奇數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---反向偶數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---載體骨架”或者多克隆位點(diǎn)序列右側(cè)待添加目標(biāo)序列R_n的順序排列：“載體骨架---正向偶數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---反向奇數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基---正向奇數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---反向克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---任意堿基---正向克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---反向偶數(shù)位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)---載體骨架”排列，且此供給載體B2的載體骨架中不含有克隆內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，其中m=1，3，5，7……等奇數(shù)，n=2，4，6，8……等偶數(shù)；?