[發明專利]一種多片段DNA分子組裝方法及應用

有效

• 申請號: 201310094572.6
• 申請日: 2013-03-22
• 公開（公告）號: CN103215296A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 李陽;李陽生;盧楠
• 申請（專利權）人: 武漢伯遠生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒

1.一種多片段DNA分子組裝方法，其特征在于包括以下步驟：

1）載體系統構建：該系統包括由接受載體A1、供給載體B1和/或供給載體B2組成的系統，?

所述接受載體A1的多克隆位點中含有一組內切酶識別位點，且按照：“載體骨架---反向內切酶識別位點---任意堿基----正向內切酶識別位點----載體骨架”?排列，且載體骨架中不含有此內切酶的識別位點；?

所述供給載體B1的多克隆位點中含有三組內切酶位點，且按照多克隆位點序列左側待添加目標序列L_m的順序排列：“載體骨架---正向奇數位內切酶識別位點--反向克隆內切酶識別位點---任意堿基---正向克隆內切酶識別位點--反向偶數位內切酶識別位點---任意堿基----正向偶數位內切酶識別位點---反向奇數位內切酶識別位點---載體骨架”，或者多克隆位點序列右側添加目標序列R_n的順序排列：“載體骨架---正向奇數位內切酶識別位點---反向偶數位內切酶識別位點---任意堿基---正向偶數位內切酶識別位點--反向克隆內切酶識別位點---任意堿基---正向克隆內切酶識別位點---反向奇數位內切酶識別位點---載體骨架”?排列，且此供給載體B1的載體骨架中含有的克隆內切酶識別位點被全部剔除，其中m=1，3，5，7……等奇數，n=2，4，6，8……等偶數；?

所述供給載體B2的多克隆位點中含有三組內切酶位點，且按照多克隆位點序列左側待添加目標序列L_m的順序排列：“載體骨架---正向偶數位內切酶識別位點--反向克隆內切酶識別位點---任意堿基---正向克隆內切酶識別位點--反向奇數位內切酶識別位點---任意堿基----正向奇數位內切酶識別位點---反向偶數位內切酶識別位點---載體骨架”或者多克隆位點序列右側待添加目標序列R_n的順序排列：“載體骨架---正向偶數位內切酶識別位點---反向奇數位內切酶識別位點---任意堿基---正向奇數位內切酶識別位點---反向克隆內切酶識別位點---任意堿基---正向克隆內切酶識別位點---反向偶數位內切酶識別位點---載體骨架”?排列，且此供給載體B2的載體骨架中不含有克隆內切酶識別位點，其中m=1，3，5，7……等奇數，n=2，4，6，8……等偶數；

2）目標序列L_m和R_n克隆進入供給載體B1和/或供給載體B2：分別先將目標序列L_m和R_n通過PCR進行擴增，同時在PCR引物兩端添加內切酶位點，使得通過酶切后產生與供給載體B1和/或供給載體B2上的克隆內切酶產生相同的粘末端，將目標序列L_m和R_n克隆進入供給載體B1和/或供給載體B2將供給載體B1和/或供給載體B2上的“---反向克隆內切酶識別位點---任意堿基---正向克隆內切酶識別位點---”替代下來，得到載體B1-L_m?和/或載體B1-R_n、載體B2-?R_n和/或載體B2-L_m其中m=1，3，5，7……等奇數，n=2，4，6，8……等偶數；?

3）多片段組裝：

a、將接受載體A1與載體B1-L₁或載體B2-L₁進行酶切連接反應，載體B1-L₁或載體B2-L₁上的目標序列L₁將被轉移到接受載體A1上，得到載體A1-L₁，

b、將載體A1-L₁和載體B2-?R₂或載體B1-R₂用內切酶消化，然后用連接酶將載體A1-L₁和R₂連接得到載體A1-L₁-R₂；

c、將載體A1-L₁-R₂和載體B1-L₃或載體B2-L₃用內切酶消化，然后用連接酶將載體A1-L₁-R₂和L₃連接得到載體A1-L₁-R₂-L₃；

d、如此往復，直到完成得到載體A1-L₁-R₂-L₃-R₄-L₅……-L_m-?R_n大片段的組裝，其中m=1，3，5，7……等奇數，n=2，4，6，8……等偶數。