[發明專利]一種基于單一標準品的四色熒光定量PCR方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201310092074.8
• 申請日: 2013-03-21
• 公開（公告）號: CN103146846A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 劉健翊;周孟;陳瑤;王寶玉;廖杰;葉奕東;黃佳柳;莫海月;徐德峰;黃常艷;徐貴云
• 申請（專利權）人: 廣州維伯鑫生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
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技術領域

本發明涉及病毒核酸檢測，屬于生物技術領域。本發明采用基于單一標準品的四重四色的熒光定量PCR技術，通過一步法PCR擴增檢測各類處理后標本中A組輪狀病毒（HRVA）、諾如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、諾如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星狀病毒（HAstV）RNA，用于引起腹瀉癥候群的輪狀病毒、諾如病毒Ⅰ群、諾如病毒Ⅱ群和人星狀病毒的實驗室快速檢測和疫情監控。本發明對引物和探針的設計以及實驗的實施也提出了更高的要求。

背景技術

WHO估計全世界每年腹瀉病例高達30-50億例次，有50-100萬病例因嚴重腹瀉死亡，平均每天死亡2.5萬人，特別在兒童更為突出。臨床上小兒各種急性胃腸炎比較常見，可以引起患者嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，是一種急性傳染病，一般起病較急，可有發熱及全身不適癥狀。引起急性腹瀉的病原很多，可以包括細菌病毒或者其他微生物。自1972年發現諾瓦克病毒后，已相繼發現和確立了多種引起腹瀉的病毒并能在腹瀉患者大便中直接檢出病毒。目前研究較多的是各種致病性病毒包括輪狀病毒（Rotavirus，RV）、諾如病毒（Norovirus，NV）、人星狀病毒（Human?Astrovirus，HAstV）以及腸道病毒71型（Enterovirus?71，EV71）、柯薩奇病毒（Coxsackie?virus，CAV）、札如病毒?(Sapovirus，SV)和腸腺病毒（Enteric?adenovirus，EADV）等。

輪狀病毒主要感染嬰幼兒，秋冬季高發；腸道腺病毒主要感染2歲以下患兒，夏秋季發病率較高。輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，病毒粒子呈圓形，由形似車輪而得名，為無囊膜病毒，病毒基因含有11個節段的雙股線型RNA。目前將人和動物狀病毒分為A～D4個組。A組為普通輪狀病毒（主要引起嬰幼兒腹瀉）；B組為豬輪狀病毒和成人腹瀉輪狀病毒（Adult?diarrhea?rotavirus），C組為人和豬輪狀病毒；D組為雞和鳥類輪狀病毒。具有11個片斷的雙股RNA基因組編碼6個結構蛋白(VP1-4，VP6-7)和五個非結構蛋白(NSP1-5)，包裹在三層蛋白衣殼內；外層由兩個蛋白組成，VP4和VP7，VP4(相對分子質量為88000)蛋白，呈穗狀刺突突出于病毒粒子的表面，VP5包含宿主細胞融合區氨基酸384-401，與潛在融合區序列和抗原環繞的氨基酸305有關。VP7是病毒主要的衣殼蛋白。本發明主要針對A組輪狀病毒檢測。

諾如病毒最早是從1968年在美國諾瓦克市暴發的一次急性腹瀉的患者糞便中分離的病原體，是單股正鏈RNA，全長約7642nt，包括3?個開放閱讀框（Open?Reading?Frame，ORF）。目前已對其?100?多個分離株進行基因測序。世界不同地區、不同時間流行的NV基因RNA多聚酶區序列相對保守，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的達到90%以上。NV包括5?個基因群，感染人的包括基因Ⅰ、Ⅱ和IV群，其中以Ⅱ群最多見，Ⅰ群偶見，IV罕見報道。基因群Ⅰ（GenogroupⅠ，NVGⅠ）還包括南安普頓病毒（Southampton?virus）、沙漠風暴病毒（Desert?Shield?virus）；基因群Ⅱ（Genogroup?Ⅱ，NVGⅡ）還包括雪山病毒（Snow?Mountain?virus）、夏威夷病毒（Hawaii?virus）、多倫多病毒（Toronto?virus）等。因此目前諾如病毒的檢測引物以針對Ⅰ（NVGⅠ）和Ⅱ（NVGⅡ）群兩種基因型為主。諾如病毒與在日本發現的札幌樣病毒（Sapporo-like?Virus，SLV），現在的正式名稱為札如病毒(Sapovirus，SV)，合稱為人類杯狀病毒。

星狀病毒性胃腸炎主要發生在5歲以下兒童，也可見于老年人。星狀病毒于1975年由Appleton和Higgins采用電鏡在腹瀉兒童的糞便標本中首次發現，星狀病毒科包括哺乳類星狀病毒（Mamastroviruses）和鳥星狀病毒（Avastroviruses）兩個屬，人類星狀病毒歸屬于哺乳類星狀病毒屬。星狀病毒呈球形，核衣殼為規則20面體，無胞膜，病毒顆粒直徑為28nm，約10%的病毒顆粒有特征性的5～6個角；細胞培養獲得的病毒顆粒直徑為41nm，包括10nm?的刺突。人類星狀病毒可分為7個血清型（AstV21～AstV27），7個基因型，人類星狀病毒血清型1（HastV21）是流行最廣泛的血清型。核酸為單正鏈RNA，7.0kb，兩端為非編碼區，中間有三個重疊的開放讀碼框架（ORF）。該病毒呈世界性分布。