[發明專利]一種基于單一標準品的四色熒光定量PCR方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201310092074.8
• 申請日: 2013-03-21
• 公開（公告）號: CN103146846A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 劉健翊;周孟;陳瑤;王寶玉;廖杰;葉奕東;黃佳柳;莫海月;徐德峰;黃常艷;徐貴云
• 申請（專利權）人: 廣州維伯鑫生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發明的基于單一標準品的四重四色的熒光定量PCR技術，其特征在于采用單一的標準品作為實驗的陽性對照和定量標準通過一步法PCR擴增檢測各類處理后標本中A組輪狀病毒（HRVA）、諾如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、諾如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星狀病毒（HAstV）RNA，用于引起腹瀉癥候群的常見的A輪狀病毒、諾如病毒Ⅰ群、諾如病毒Ⅱ群和人星狀病毒的實驗室快速高通量檢測和疫情監控。

2.根據權利要求1所述的一種檢測方法，本發明的檢測方法實驗步驟包括：1）感染或疑似樣本采集和運送；2）樣本預處理和提取RNA；3）一步法四重四色熒光定量PCR樣本進行檢測；4）根據單一標準品的擴增曲線標本中的病毒進行精確定量。

3.根據權利要求1所述的檢測方法和試劑盒，用于檢測A組輪狀病毒（HRVA）、諾如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、諾如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星狀病毒（HAstV）特異性的引物和熒光探針為：A組輪狀病毒上游引物HRVA-F1（SEQ?ID?NO.1）、下游引物HRVA-R1（SEQ?ID?NO.2）和熒光探針HRVA-P（SEQ?ID?NO.3）；諾如病毒Ⅰ群上游引物NVGⅠ-F1（SEQ?ID?NO.4）、下游引物NVGⅠ-R1（SEQ?ID?NO.5）和熒光探針NVGⅠ-P（SEQ?ID?NO.6）；諾如病毒Ⅱ群上游引物NVGⅡ-F1（SEQ?ID?NO.7）、下游引物NVGⅡ-R1（SEQ?ID?NO.8）和熒光探針NVGⅡ-P（SEQ?ID?NO.9）；人星狀病毒上游引物HAstV-F1（SEQ?ID?NO.10）、下游引物HAstV-R1（SEQ?ID?NO.11）和熒光探針HAstV-P（SEQ?ID?NO.12）。

4.根據權利要求3所述的特異性引物和探針，四種病毒RNA的四重四色熒光定量PCR特異性擴增檢測的靶區域分別是：A組輪狀病毒（SEQ?ID?NO.13）、諾如病毒Ⅰ群（SEQ?ID?NO.14）、諾如病毒Ⅱ群（SEQ?ID?NO.15）和人星狀病毒（SEQ?ID?NO.16）。

5.根據權利要求1所述的一種試劑盒，針對A組輪狀病毒（HRVA）、諾如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、諾如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星狀病毒（HAstV）四種病毒的靶序列進行分析并在各序列之間引入無義序列，設計4段不同的標準品序列，每個片段在100-120bp之間，接頭處有不少于6-8個序列重復，以病毒靶片段為模版進行第二次擴增，在體外將所有對應的擴增片段混合作為模板經第三次PCR擴增即可拼接得到單一的長片段基因，作為單一標準品的核酸序列，克隆入pMD18-T載體，制備成標準品。

6.根據權利要求1所述的一種單一標準品的四重四色熒光定量PCR檢測試劑盒，制備該種制備成標準品的用到的引物為A組輪狀病毒上游引物HRVA-F2（SEQ?ID?NO.17）和下游引物HRVA-R2（SEQ?ID?NO.18），擴增片段為（SEQ?ID?NO.19）；諾如病毒Ⅰ群上游引物NVGⅠ-F2（SEQ?ID?NO.20）和下游引物NVGⅠ-R2（SEQ?ID?NO.21），擴增片段序列為（SEQ?ID?NO.22）；諾如病毒Ⅱ群上游引物NVGⅡ-F2（SEQ?ID?NO.23）、下游引物NVGⅡ-R2（SEQ?ID?NO.24），擴增片段序列為（SEQ?ID?NO.25）；針對人星狀病毒上游引物HAstV-F2（SEQ?ID?NO.26）和下游引物HAstV-R2（SEQ?ID?NO.27），擴增片段序列為（SEQ?ID?NO.28），最終經過第三次擴增HRVA-NVGⅠ-NVGⅡ-HAstV單一標準品的模板片段序列為（SEQ?ID?NO.29）。

7.根據權利要求1其中所述的試劑盒，反應體系（PCR?MIX）的按照如下方式配制：每份反應液(PCR?MIX)體積為20.0ul，然后加入逆轉錄酶系1.0ul、Taq酶系1.0ul、RNA/標準品/陰性對照3.0ul，無需經過單獨進行逆轉錄反映直接一步法進行擴增。

8.根據權利要求1所述的四重熒光定量PCR試劑盒，每個反應槽同時選擇FAM、HEX、ROX和CY5熒光通道，分別對應A組輪狀病毒（HRVA）、諾如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、諾如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星狀病毒（HAstV）RNA的檢測。

9.根據權利要求1所述的四重熒光定量PCR試劑盒，使用Stratagene公司的Mx3000P和Mx3005P、ABI?PRISM7300/7500、ABI?PRISM?7700、ABI?PRISM5700、ABI?GeneAmp?7000、MJ?Opticon等使用熒光定量PCR儀，擴增條件為?42℃→20分鐘，然后93℃→2分鐘，然后93℃?30秒→55℃?45秒（在此步驟采集熒光信號），40個循環。