[發明專利]制備二肽基肽酶IV抑制劑的方法及用于該制備方法的中間體

有效

• 申請號: 201310089630.6
• 申請日: 2005-04-13
• 公開（公告）號: CN103215321A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 邁克爾.波利蒂諾;馬修.M.卡丁;保羅.M.斯科尼茲尼;賈森.G.陳
• 申請（專利權）人: 布里斯托爾-邁爾斯.斯奎布公司
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C12N9/04;C07D207/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 封新琴

1.一種制備式3結構的經BOC-保護的胺的方法,

式3

其包括

a.制備部分純化的苯丙氨酸脫氫酶/甲酸脫氫酶的酶濃縮物；及

b.使用甲酸銨、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、二硫蘇糖醇及該部分純化的苯丙氨酸脫氫酶/甲酸脫氫酶的酶濃縮物處理式1結構的酮酸的水溶液；

式1

c.使用氫氧化鈉調節反應混合物的pH以形成基本上不含有不希望的過量銨離子的所需的胺；及

式2

d.在不離析該氨基酸中間體的情況下，使用二碳酸二叔丁酯處理上述水溶液以生成以下結構的經BOC-保護的胺

式3

2.權利要求1所述的方法，其中進行調節該反應混合物的pH的步驟以將該反應混合物的pH維持在約7.0至約8.6。

3.權利要求1的方法，其中進行調節該反應混合物的pH的步驟以將該反應混合物的pH維持在8.0±0.2。

4.權利要求1-3中任一項的方法，其中以這樣的量添加甲酸銨，以提供約1.9:1至約2.5:1的范圍內的甲酸銨:式1酸的摩爾比例。

5.權利要求1-4中任一項的方法，其中以這樣的量添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，以提供約500:1至約1500:1的范圍內的NAD:式1酸的摩爾比例。

6.權利要求1-5中任一項的方法，其中步驟c的反應混合物維持在約25℃至45℃的范圍內的溫度。

7.權利要求1-6中任一項的方法，其中該部分純化的苯丙氨酸脫氫酶/甲酸脫氫酶濃縮物經由包括下列步驟的方法制備：

a.制備能夠產生苯丙氨酸脫氫酶和/或甲酸脫氫酶的微生物的發酵培養液；

b.對該培養液進行微流體化以從所得的細胞中釋放出活性且形成具有PDH及/或FDH活性的微流體化的培養液；

c.經由使用絮凝劑處理該培養液以凝結細胞碎屑而澄清該培養液；

d.過濾該澄清的培養液；及

e.濃縮該培養液以得到具有對于PDH為至少約400IU/毫升和對于FDH為至少約20IU/毫升的PDH/FDH活性的經純化的酶濃縮物。

8.權利要求7的方法，其中在保持該培養液的溫度低于約40℃的同時對該培養液進行微流體化。

9.權利要求8的方法，其中保持該培養液的溫度在約4℃至約30℃的范圍內。

10.權利要求1-6中任一項的方法，其中部分純化的苯丙氨酸脫氫酶/甲酸脫氫酶(PDH/FDH)是通過包括下述的方法制備的：

a.制備能夠產生苯丙氨酸脫氫酶及甲酸脫氫酶的大腸桿菌(Escherichia?coli)的發酵培養液；

b.在8000至30,000psi范圍內的壓力下對該培養液進行微流體化，同時保持該培養液的溫度在4至30℃的范圍內，以從所得的細胞中釋放出活性且形成含有苯丙氨酸脫氫酶及甲酸脫氫酶的微流體化培養液；

c.經由使用絮凝劑處理該培養液以凝結細胞碎屑并除去DNA和不需要的蛋白質而澄清該培養液；

d.過濾該澄清的培養液；及

e.濃縮該培養液以得到具有對于苯丙氨酸脫氫酶為至少約400IU/毫升和對于甲酸脫氫酶為至少約20IU/毫升的苯丙氨酸脫氫酶及甲酸脫氫酶活性的部分純化的酶濃縮物。

11.權利要求7-10中任一項的方法，其中在約12,000至約20,000psi范圍內的壓力下對該培養液進行微流體化。

12.權利要求7-11中任一項的方法，其中該苯丙氨酸脫氫酶得自芽孢八迭球菌屬(Sporosarcina)或熱放線菌屬(Thermoactinomyces)。

13.權利要求7-11中任一項的方法，其中該苯丙氨酸脫氫酶得自中間型嗜熱放線菌(Thermoactinomyces?intermedius)。

14.權利要求7-11中任一項的方法，其中該苯丙氨酸脫氫酶得自中間型嗜熱放線菌ATCC33205，其在大腸桿菌或巴斯德畢氏酵母(Pichia?pastoris)中表達。