[發(fā)明專利]一種蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310089139.3
• 申請(qǐng)日: 2013-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103275170A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張彩霞;叢佩華;張利義;康國(guó)棟;田義;王強(qiáng);楊玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14
• 代理公司: 沈陽(yáng)晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 任玉龍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物葉片全蛋白提取方法領(lǐng)域，特別涉及了一種蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)作為功能基因組學(xué)研究的重要支柱，已成為新世紀(jì)生命科學(xué)研究的前沿和熱門領(lǐng)域。近年來(lái)，隨著果樹(shù)基因組研究工作的不斷深入和完善，蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)已有應(yīng)用于蘋果、梨、葡萄、桃、香蕉等主栽果樹(shù)品種上的研究報(bào)導(dǎo)，為果樹(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開(kāi)展提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

雙向電泳技術(shù)作為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)之一，目前已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。雙向電泳研究過(guò)程中涉及的影響因素很多，研究證實(shí)，蛋白質(zhì)樣品的提取和純化是雙向電泳研究的前提，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵。

關(guān)于蘋果葉片蛋白質(zhì)提取方法的研究報(bào)道中，雙向電泳圖譜的質(zhì)量仍然不是很好，有必要對(duì)蘋果葉片總蛋白提取技術(shù)做進(jìn)一步研究。因蘋果葉片富含酚類、色素、多糖等多種次生代謝物質(zhì)，嚴(yán)重影響了蛋白質(zhì)樣品的純度，使其制備工作較為困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是以田間蘋果幼嫩葉片為試材，實(shí)現(xiàn)蘋果屬植物葉片材料總蛋白的提取，為蘋果葉片相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供依據(jù)，特提供了一種蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法。

本發(fā)明提供了一種蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法，其特征在于：所述的蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法，具體為：

采摘葉齡為20～25天的幼嫩葉片，無(wú)菌水清洗后快速風(fēng)干，用鋒利刀片去除葉片葉柄部分，準(zhǔn)確稱取2克，用液氮在研缽中迅速研磨成精細(xì)粉末，粒徑約為40-60微米，研磨時(shí)間3分鐘；

加入4ml的勻漿緩沖液，4℃下渦旋振蕩10分鐘；

勻漿液中加入等體積的Tris-飽和酚，具體為三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制的pH?8.0的苯酚溶液，4℃下，渦旋搖蕩20分鐘；

將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，4℃下15000×g，離心30分鐘，上層酚相轉(zhuǎn)移新離心管；

重新加入同體積的上述勻漿緩沖液,4℃下渦旋震蕩10分鐘，15000×g離心10分鐘；

繼續(xù)回收酚相，加入5倍體積0.1M甲醇醋酸銨溶液，-20℃條件下沉淀4小時(shí)以上；

溶液在4℃下，15?000×g，離心10分鐘，沉淀物經(jīng)冷丙酮（含20mM二硫蘇糖醇）漂洗三次，室溫風(fēng)干，得到蛋白干粉，-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->

所述的勻漿緩沖液中含有20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（pH?7.5）、250mM蔗糖、10mM乙二醇-雙(2-氨基乙醚)四乙酸、1mM苯甲基磺酰氟、1mM二硫蘇糖醇、1%聚乙二醇辛基苯基醚X-100、10%聚乙烯聚吡咯烷酮。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明所述的蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法，以田間蘋果幼嫩葉片為研究試材，蘋果屬植物葉片材料總蛋白提取純度高，方法簡(jiǎn)單，為研究蘋果葉片相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了依據(jù)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法，其特征在于：所述的蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法，具體為：

采摘葉齡為20天的幼嫩葉片，無(wú)菌水清洗后快速風(fēng)干，用鋒利刀片去除葉片葉柄部分，準(zhǔn)確稱取2克，用液氮在研缽中迅速研磨成精細(xì)粉末，粒徑約為40微米，研磨時(shí)間3分鐘；

加入4ml的勻漿緩沖液，4℃下渦旋振蕩10分鐘；

勻漿液中加入等體積的Tris-飽和酚，具體為三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制的pH?8.0的苯酚溶液，4℃下，渦旋搖蕩20分鐘；

將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，4℃下15000×g，離心30分鐘，上層酚相轉(zhuǎn)移新離心管；

重新加入同體積的上述勻漿緩沖液,4℃下渦旋震蕩10分鐘，15000×g離心10分鐘；

繼續(xù)回收酚相，加入5倍體積0.1M甲醇醋酸銨溶液，-20℃條件下沉淀4小時(shí)以上；

溶液在4℃下，15?000×g，離心10分鐘，沉淀物經(jīng)冷丙酮（含20mM二硫蘇糖醇）漂洗三次，室溫風(fēng)干，得到蛋白干粉，-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的勻漿緩沖液中含有20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（pH?7.5）、250mM蔗糖、10mM乙二醇-雙(2-氨基乙醚)四乙酸、1mM苯甲基磺酰氟、1mM二硫蘇糖醇、1%聚乙二醇辛基苯基醚X-100、10%聚乙烯聚吡咯烷酮。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法，其特征在于：所述的蘋果屬植物葉片全蛋白提取方法，具體為：