[發(fā)明專利]多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310089101.6
• 申請日: 2013-03-20
• 公開（公告）號(hào): CN103184235A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石德順;張曉溪;崔奎青;劉慶友;李湘萍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/867;C12N15/66;C12Q1/70;C12Q1/68;A61K49/00;A01K67/027
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1.一種多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體，其特征在于：所述表達(dá)載體為載體一或載體二，其中載體一為pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP；或載體二為LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體，其特征在于：多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體中Cons1如序列1所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。

3.權(quán)利要求1或2所述的多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括下述步驟：

(1)、根據(jù)GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守區(qū)，化學(xué)合成3個(gè)shRNA串聯(lián)的Cons1-Cons2-Cons3片段，連入pMD-18T載體，得到p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP載體；其中Cons1-Cons2-Cons3中在Cons1的5’端設(shè)有XbaI/SacI雙酶切位點(diǎn)，在Cons1和Cons2之間設(shè)有ClaI/XhoI雙酶切位點(diǎn)，在Cons2和Cons3之間設(shè)有BglII/MluI雙酶切位點(diǎn)，在Cons3的3’端設(shè)有LoxP/NotI雙酶切位點(diǎn)；

(2)、以水牛基因組為模板，以SEQ?No.4/SEQ?No.5為引物擴(kuò)增出水牛7SK的啟動(dòng)子bu7SK；以水牛基因組為模板，以SEQ?No.6/SEQ?No.7為引物擴(kuò)增出水牛U6的啟動(dòng)子buU6；以牛基因組為模板，以SEQ?No.8/SEQ?No.9為引物擴(kuò)增出牛U6的啟動(dòng)子boU6；

(3)、對步驟(2)中得到的啟動(dòng)子片段和步驟(1)得到的載體分別進(jìn)行雙酶切后連接，依次將啟動(dòng)子bu7SK、啟動(dòng)子buU6和啟動(dòng)子boU6連入步驟(1)的p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP載體中，得到載體p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP；

(4)、用XbaI/NotI雙酶切載體p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP，得到XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI；以慢病毒載體質(zhì)粒pSicoR為載體骨架，用XbaI/NotI雙酶切載體骨架后，用T4連接酶將XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI連接入XbaI/NotI雙酶切后的pSicoR質(zhì)粒中，得到多個(gè)抗口蹄疫shPRNA串聯(lián)表達(dá)載體一pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP；

(5)、將載體一與慢病毒包裝質(zhì)粒pNRF和pVsvg在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，得到載體二LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)具體方法如下：

(a)、首先用內(nèi)切酶XbaI/SacI將p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切開，將bu7SK啟動(dòng)子用T4連接酶連接至Cons1的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP；

(b)、其次用內(nèi)切酶ClaI/XhoI將p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切開，將buU6啟動(dòng)子用T4連接酶連接至Cons2的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP；

(c)、最后用內(nèi)切酶MluI/BglII將p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP切開，將boU6啟動(dòng)子用T4連接酶連接至Cons3的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP。

5.由權(quán)利要求1或2所述的多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體在檢測由該載體表達(dá)的shRNA抑制口蹄疫病毒復(fù)制方面的應(yīng)用或者在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠方面的應(yīng)用。