[發明專利]大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法

無效

• 申請號: 201310087386.X
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN103146845A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 陶小榮;張雯娜;衛其巍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于生物監測領域，涉及大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法。

背景技術

大豆花葉病毒（Soybean?mosaic?virus，SMV）是一種在世界很多國家廣泛分布并極具破壞性的一種的病毒，每年都會給很多國家帶來巨大的農業經濟損失。由于該病害在世界范圍內廣泛分布并普遍發生，導致大豆嚴重減產和種質衰退，所以發展SMV病毒病害的快速檢測方法對于該病害的診斷及準確把握該病害的流行規律和提出有效防治措施非常重要。目前大豆花葉病毒病的檢測包括生物學鑒定、電鏡鑒定、酶聯免疫反應（ELISA）和逆轉錄聚合酶鏈式擴增反應（RT-PCR）。

環介導逆轉錄等溫擴增（Reverse?Transcription?Loop-Mediated?Isothermal?Amplification,RT-LAMP）是近幾年新發展出的一種新型的基因擴增技術，它的優點包括擴增時間短、靈敏度高以及不需要昂貴的循環擴增儀器，它已被廣泛應用于多種人類流行性病毒的檢測。這種技術也逐漸被應用于植物病毒的檢測，但是RT-LAMP檢測目前還沒有被用于SMV的快速檢測上。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足之處，提供一種大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種用于大豆花葉病毒檢測的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測的引物組，正向外引物F3的序列為SEQ?ID?NO.1，反向外引物B3的序列為：SEQ?ID?NO.2，正向內引物FIP的序列為：SEQ?ID?NO.3，反向內引物BIP的序列為：SEQ?ID?NO.4。

所述的引物組在制備一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測大豆花葉病毒的試劑盒中的應用。

一種用于大豆花葉病毒檢測的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測的試劑盒，包含本發明所述的引物組。

所述的試劑盒包含以下RT-LAMP反應液：

*括號中的濃度表示相應物質在反應體系中的終濃度

大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，使用本發明所述的引物組進行RT-LAMP反應，將反應產物于1%TBE瓊脂凝膠中電泳或用熒光染料SYBR?Green?I對擴增產物的可視化；反應呈陽性，表明存在大豆花葉病毒；反應呈陰性的表示待測樣品不含大豆花葉病毒。所述的反應呈陽性是指電泳結果出現典型的LAMP條帶，或擴增產物在熒光染料SYBRGreen?I存在下由橙色變為綠色；所述的反應呈陰性是指電泳結果未出現典型的LAMP條帶，或擴增產物為橙色。

所述的大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，具體包含如下步驟：

（1）對待檢樣品進行RNA粗提取得RNA粗提取液：取100mg葉片，用400μL的0.5MNaOH中快速研磨，低速離心后快速取10μL上清于490μL的100mM?Tris–HCl(pH8)溶液中，混勻待用；

（2）以提取的RNA為模板，以所述的特異性引物F3、B3、FIP及BIP為引物配制RT-LAMP反應溶液，反應液組成如下：

*括號中的濃度表示相應物質在反應體系中的終濃度

（3）將配好的RT-LAMP反應溶液于65℃的反應溫度中進行反應，反應時間為60min，然后80℃，5min；

（4）對反應產物進行結果分析：將反應產物于1%TBE瓊脂凝膠中電泳或用熒光染料SYBRGreen?I對擴增產物的可視化，反應呈陽性，表明存在大豆花葉病毒；反應呈陰性的表示待測樣品不含大豆花葉病毒。

有益效果：

本發明首次公開了大豆花葉病毒的RT-LAMP檢測方法。本發明選取SMV?CP保守區序列(GenBank:HM590055.1)作為靶序列，篩選出特異性引物組，保證了RT-LAMP檢測中對SMV的特異性，以及對不同株系SMV檢測的通用性。

本發明通過將RNA快速粗提取方法與SMV?RT-LAMP檢測相結合，以快速粗提取的待測樣品總RNA作RT-LAMP的反應模板，節省了一般RT-LAMP采用常規RNA抽提方法所花費的冗余時間，簡化了操作過程，加快了SMV檢查速度，實現對大豆花葉病毒的一步檢測。

附圖說明