[發明專利]大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法

無效

• 申請號: 201310087386.X
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN103146845A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 陶小榮;張雯娜;衛其巍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

1.一種用于大豆花葉病毒檢測的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測的引物組，其特征在于正向外引物F3的序列為SEQ?ID?NO.1，反向外引物B3的序列為：SEQ?ID?NO.2，正向內引物FIP的序列為：SEQ?ID?NO.3，反向內引物BIP的序列為：SEQ?ID?NO.4。

2.權利要求1所述的引物組在制備一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測大豆花葉病毒的試劑盒中的應用。

3.一種用于大豆花葉病毒檢測的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測的試劑盒，其特征在于包含權利要求1所述的引物組。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含以下RT-LAMP反應液：

5.大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，其特征在于使用權利要求1所述的引物組進行RT-LAMP反應，反應呈陽性的，表明存在大豆花葉病毒，反應呈陰性的表示待測樣品不含大豆花葉病毒。

6.根據權利要求5所述的大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，其特征在于具體包含如下步驟：

（1）對待檢樣品進行RNA粗提取得RNA粗提取液；

（2）以提取的RNA為模板，以所述的特異性引物F3、B3、FIP及BIP為引物配制RT-LAMP反應溶液；

（3）將配好的RT-LAMP反應溶液于65°C的反應溫度中進行反應，反應時間為60min，然后80℃，5min；

（4）對反應產物進行結果分析：將反應產物于1%TBE瓊脂凝膠中電泳或用熒光染料SYBRGreen?I對擴增產物的可視化，反應呈陽性，表明存在大豆花葉病毒；反應呈陰性的表示待測樣品不含大豆花葉病毒。

7.根據權利要求6所述的大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，其特征在于所述的RNA粗提取液的提取方法為：以1mg:4μL的比例，取葉片于0.5M的NaOH中進行研磨，例如取100mg葉片，用400μL的0.5M?NaOH中快速研磨后，低速離心后快速取10μL上清于490μL的100mM?pH8.0Tris–HCl溶液中，混勻待用。

8.根據權利要求6所述的大豆花葉病毒的一步法環介導逆轉錄等溫擴增檢測方法，其特征在于所述的RT-LAMP反應溶液組成為：