[發明專利]母豬糞便孕激素的酶免測定法及檢測母豬發情期的方法

無效

• 申請號: 201310087012.8
• 申請日: 2013-03-19
• 公開（公告）號: CN103175960A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 石放雄;馮建剛;李君榮;李巖;黃瑞華;林明新
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/31;G01N33/74
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技術領域

本發明涉及一種母豬糞便孕激素的酶免測定法，測定糞便中孕激素濃度以監控母豬卵巢活動，屬于生物技術領域。

背景技術

酶聯免疫吸附測定法(ELISA)的原理：競爭性ELISA的原理是先將抗體包被于固相，之后加入一定待測樣本(含待測抗原)和一定量的酶標抗原結合物，此時它們能競爭性的與固相抗體結合，再經孵育洗滌后加底物顯色，測定它們的OD₄₉₂值，根據標準曲線計算出待測物含量。如果樣品中孕酮含量高，則包被在固相載體上的大多數孕酮抗體為樣品中的游離孕酮結合，此時酶標孕酮結合就相對較少，在洗的時候，結合在包被抗體的孕酮沒有被洗，而游離的酶標孕酮被洗，加底物顯色，顏色就淺。反之，如果孕酮含量低，酶標孕酮就會與抗體結和，被洗掉的是游離的孕酮，酶標孕酮被固定在板上，加底物顯色，顏色深。

運用ELISA方法測定生殖激素監控生殖器官活動在生產中的應用：雌/孕激素的含量變化是卵巢上卵泡、黃體發育的結果，是母畜卵巢功能的體現。母畜周期性發情的實質是卵巢上黃體與卵巢的交替發育并最終體現在雌/孕激素的含量上的變化。因此通過測定雌/孕激素濃度有助于了解卵巢活動狀態和卵巢分泌功能，監控動物的繁殖育種能力，對發情鑒定、早期妊娠診斷及卵巢功能診斷有著重要意義。在生產過程中，通常運用ELISA方法對采集的動物血樣進行雌/孕激素含量的測定，但這種采樣方法會對動物產生一定的應激，并且實施有一定的難度。

由于類固醇激素在動物體內血液中迅速被結合，然后通過不同的途徑分泌到尿液和經膽汁排到腸道中，類固醇激素通過與葡萄糖醛酸或硫酸鹽結合，形成水溶性的無活性的葡萄糖苷酸或硫酸鹽而被排泄到糞便和尿液中。動物尿液中和糞便中雌激素主要由雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇組成；在糞便中孕酮代謝物主要有5α-孕烷、5β-孕烷，這與血液中的雌激素和孕酮種類基本相同。因此，測定母畜尿液、糞便等方法以代替測定血液監測母畜卵巢及其它生殖器官的活動，此種檢測方法采樣簡單，對動物產生的負面影響小、靈敏度高，特異性好，易于操作檢測，并且結果可靠。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是針對目前利用血液測定動物孕激素含量的方法所存在的不足，如動物應激、傷害、采血難度大等現狀，利用競爭性酶免法測定糞便中生殖激素濃度以監控母豬卵巢機能，該方法所需要樣品易收集，對動物基本無傷害，測得的結果可靠，能夠代替測定動物血液方法監控動物一系列生殖活動。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種母豬糞便孕激素的酶免測定法，步驟如下：

1)樣品收集：收集母豬糞便并稱0.5g溶于20ml測定緩沖液中，離心(3000轉/分，10分鐘)，取上清，放于4℃待測；

2)競爭ELISA測定樣品中孕激素的含量：

A)孕酮抗體包被：用含1∶10000抗體的包被緩沖液包被96孔酶標板，4℃冰箱放置24小時，待用；

B)封閉：舍去內容物，封閉緩沖液封閉包被孔，每孔280μl，37℃放置2h；

C)加待測樣：取出包被板，舍去內容物，用洗滌液沖洗三次，3分鐘/次；然后每孔加入待測樣品100ul/孔，再加1∶10000倍的孕酮酶標物工作液，37℃溫育2小時以上；

D)顯色：用洗滌液沖洗三次，3分鐘/次；加入底物液，200ul/孔，37℃避光，放置30分鐘以上；

E)終止：加入終止液，終止酶促反應；

F)讀取OD_492nm值：用酶標儀在492nm波長處讀取各孔的光密度值；

G)OD值到濃度的換算：將標準曲線直線化：設樣本孕酮濃度為X，結合率(E/E0：樣品孔的OD值/零標準孔的OD值))為y可得方程y＝a+blnx，利用回歸方程即可求得待測樣本的孕酮含量pg/100ul工作液。

所述步驟(1)中的測定緩沖液為碳酸鹽緩沖液(pH值為9.6)、Tris鹽酸緩沖液(pH值為7.4)、磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)或蒸餾水(pH值為7.0)，優選蒸餾水。

所述標準曲線的回歸方程為：E/E0＝-8.387lnx+108.7(r＝-0.9932)。

一種檢測母豬發情期的方法：利用上述方法測定母豬糞便中的孕酮濃度，然后做出判斷：空懷母豬糞樣孕酮含量為50～200ng/g時，可以確認為發情；當配種后母豬孕酮的含量超過330ng/g糞樣時，可以確認其妊娠；小于190ng/g糞樣時，可以確認其沒有妊娠。