[發明專利]母豬糞便孕激素的酶免測定法及檢測母豬發情期的方法

無效

• 申請號: 201310087012.8
• 申請日: 2013-03-19
• 公開（公告）號: CN103175960A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 石放雄;馮建剛;李君榮;李巖;黃瑞華;林明新
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/31;G01N33/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種母豬糞便孕激素的酶免測定法，其特征在于：步驟如下：

1)樣品收集：收集母豬糞便并稱0.5g溶于20ml測定緩沖液中，離心，取上清，放于4℃待測；

2)競爭ELISA測定樣品中孕激素的含量：

A)孕酮抗體包被：用含1∶10000抗體的包被緩沖液包被96孔酶標板，4℃冰箱放置24～48小時，待用；

B)封閉：舍去內容物，封閉緩沖液封閉包被孔，每孔280μl，37℃放置2h；

C)加待測樣：取出包被板，舍去內容物，用洗滌液沖洗三次，3分鐘/次；然后每孔加入待測樣品100ul，再加1∶10000倍的孕酮酶標物工作液，37℃溫育2小時以上；

D)顯色：用洗滌液沖洗三次，3分鐘/次；加入底物液，200ul/孔，37℃避光，放置30分鐘以上；

E)終止：加入終止液，終止酶促反應；

F)讀取OD_492nm值：用酶標儀在492nm波長處讀取各孔的光密度值；

G)OD值到濃度的換算：將標準曲線直線化：設樣本孕酮濃度為x，結合率(E/E0：樣品孔OD值/零標準孔OD值)為y，可得方程y＝a+blnx，利用回歸方程即可求得待測樣本的孕酮含量pg/100ul工作液。

2.根據權利要求1所述的母豬糞便孕激素的酶免測定法，其特征在于：所述步驟(1)中的測定緩沖液為pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液、pH值為7.4的Tris鹽酸緩沖液、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水。

3.根據權利要求1所述的母豬糞便孕激素的酶免測定法，其特征在于：所述包被緩沖液的組成為：Na₂CO₃?0.795g、NaHCO₃?1.465g、H₂O?500ml。

4.根據權利要求1所述的母豬糞便孕激素的酶免測定法，其特征在于：所述封閉緩沖液的組成為：2.0gBSA加0.05mol/L、pH7.0磷酸鹽緩沖液溶解定量至100ml；所述磷酸鹽緩沖液的組成為：Na₂HPO₄·12H₂O?10.925g，NaH₂PO₄·2H₂O?3.04g，NaCl?4.35g，H₂O?500ml。

5.根據權利要求1所述的母豬糞便孕激素的酶免測定法，其特征在于：所述洗滌液的組成為：250μl吐溫20加0.05mol/L磷酸鹽緩沖液1000ml。

6.根據權利要求1所述的母豬糞便孕激素的酶免測定法，其特征在于：所述孕酮酶標物工作液是酶標物洗脫液用稀釋緩沖液稀釋成1∶10000得到的；

所述酶標物洗脫液是通過以下方法制備得到的：2.2mg孕酮-11α-半琥珀酸酯，1μl?N-甲基嗎啉，加到含有150μl?N，N’-二甲基甲酰胺的反應試管中，冷卻到-15℃，然后加入1μl氯甲酸異丁酯，該試液在-15℃反應50min，然后將其以每次10μl的滴加量緩慢滴加到事先冷卻到0℃的反應試管中，反應試管中含有濃度為0.5％的NaHCO₃水溶液100μl，以及DMF75μl，其中，NaHCO₃水溶液中溶有10.3mg的辣根過氧化物酶(HRP)，-15℃保持1h，置0℃保持4h；用蒸餾水攪拌透析30min，再用pH7.5的0.1M磷酸鹽緩沖液置4℃透析2d，接著通過Sephadex?G25過柱層析，所用洗脫液為pH7.5、濃度0.1M的PBS；過柱后，得到黃色洗脫液，用洗脫液調整光密度OD403nm至1.0，即得酶標物洗脫液；

所述稀釋緩沖液的組成為：Na₂HPO₄·12H₂O?10.925g，NaH₂PO₄·2H₂O?3.04g，NaCl?4.35g，BSA?0.5g，H₂O?500ml。