[發明專利]柔紅霉素C-14羥化酶突變體及其基因工程菌的生產方法

無效

• 申請號: 201310086638.7
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN104059892A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 余宏;徐超波;王波;陳歡斌;張道生
• 申請（專利權）人: 江蘇禾昌生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12N15/70;C12P19/56;C12R1/19
• 代理公司: 北京市振邦律師事務所 11389
• 代理人: 李朝輝

技術領域

本發明涉及生物工程制藥技術領域，特別涉及一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體及其基因工程菌的生產方法。

背景技術

蒽環類抗生素（Anthracyclines）是一類重要的抗腫瘤藥物，它們均由蒽環酮的發色團通過糖苷鍵和一種或幾種不同的糖連接而成。蒽環類抗生素主要因下列結構變化的不同而區別：蒽環上的配基不同；糖的數量、種類和排列順序不同；糖苷鍵的位置和立體化學結構不同。大多數蒽環類的抗生素具有很強的骨髓抑制和心臟毒性而不能應用于臨床，只有柔紅霉素-阿霉素型蒽環類抗生素成為臨床上最有應用價值的抗腫瘤藥物，包括柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、洋紅霉素等。

柔紅霉素（Daunorubicin，DNR）和阿霉素（Doxorubicin）在化學結構上的區別在于阿霉素C-14位為羥基，結構示意圖如說明書附圖1、附圖2所示。在臨床治療效果上，阿霉素與柔紅霉素相比，相同劑量的療效更強，毒副作用更低，且無交叉耐藥，抗腫瘤譜比柔紅霉素廣，具有更高的應用價值，成為目前應用最廣泛的抗腫瘤藥物之一。

阿霉素是柔紅霉素的C-14位羥化產物，雖然很早就發現波賽鏈霉菌青灰變種能夠產生微量的阿霉素，但是至今沒有用于工業化生產。

目前工業上生產阿霉素主要使用化學半合成法，經過七步反應獲得阿霉素：首先從取用微生物產生的柔紅霉素，用含溴的二氯甲烷進行氯化；為了防止C-7位糖鏈的斷裂，加入原甲酸三乙酯；然后在10℃環境下進行反應；所得反應物 在室溫下脫縮酮；獲得溴化柔紅霉素，然后進行轉換反應，在酸性條件下加入甲酸鈉；接著在40℃環境下進行反應，先形成柔紅霉素甲酯，然后逐漸水解成阿霉素，此時加入無水乙醇進行沉淀，直至獲得阿霉素粗品；該粗品再用微晶纖維素進行精制純化，將吸附了阿霉素的纖維柱用二氯甲烷—甲醇—水為展開劑進行分配層析，層析后的流出液在酸性條件下提取出水溶液，最后在中性條件下，再將水溶液抽提到二氯甲烷中，經脫水和減壓濃縮步驟，最終得到阿霉素精制品，所得的產品達到《美國藥典》(USP/NF)21版標準物質。

在實際生產過程中，上述流程總收率從柔紅霉素算起一般為30%左右，因此化學合成法存在著收率偏低的缺點。并且在后提煉過程中需要消耗大量有機溶劑或使用有毒性的鹵素，不僅造成生產成本提高，還很容易引起周邊的環境污染。

酶法和微生物轉化法及代謝工程生物合成途徑直接發酵法，被認為是生物法制備鹽酸阿霉素的兩種主要方法。前者實際上是一種生物體內轉化過程，在菌體發酵過程中添加可能作為前體或底物的化合物，利用生物體內存在的相關基因及其催化體系，進行底物或前體的利用及轉化，進而達到目標產物的生成效果；作為另外一種方法，代謝工程生物合成途徑，是利用基因工程或分子生物學技術，通常通過改變生物體內參與反應的相關基因及其表達產生的酶，將生物體內代謝途徑改變，達到生產所需的化學物質的目的。在上述兩種方法中，基因編碼柔紅霉素C-14羥化酶(DoxA)及其對應的C-14羥化酶作為催化制備阿霉素反應的重要參與者，受到廣泛的關注。

然而，雖然目前的現有技術的研究從幾種微生物中分離得到了doxA基因，但基因的功能性表達，例如：高酶活的doxA突變體的獲得、穩定的C-14羥化酶的高效表達等，依然處于研究的初級階段。

發明內容

因此，研究酶法和微生物轉化及生物合成直接生產阿霉素的新工藝，將是技術進步和環境友好的必由之路，不僅能夠大幅提高阿霉素的生產效率，并且較之于傳統的提煉方法，能夠極大的保護環境。

針對現有生產阿霉素主要使用化學半合成法，而造成生產率低下且污染環境的上述缺陷和問題，本發明實施例的目的是提供一種安全性更好、生產率更高且保護環境的柔紅霉素C-14羥化酶突變體及其基因工程菌的生產方法，通過定向進化技術,對目的基因進行隨機突變，并用高通量的篩選方法，獲得酶活力提高的C-14羥化酶酶突變體。

為了達到上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：

一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素C-14羥化酶突變體的基因編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突變為纈氨酸。

一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素C-14羥化酶突變體的DNA序列中第361-363bp的GAG突變為GTG。

一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素C-14羥化酶突變體的重組表達質粒的基因編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突變為纈氨酸。