[發明專利]柔紅霉素C-14羥化酶突變體及其基因工程菌的生產方法

無效

• 申請號: 201310086638.7
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN104059892A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 余宏;徐超波;王波;陳歡斌;張道生
• 申請（專利權）人: 江蘇禾昌生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12N15/70;C12P19/56;C12R1/19
• 代理公司: 北京市振邦律師事務所 11389
• 代理人: 李朝輝

1.一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素C-14羥化酶突變體的基因編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突變為纈氨酸。

2.根據權利要求1所述的一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素C-14羥化酶突變體的DNA序列中第361-363bp的GAG突變為GTG。

3.根據權利要求1所述的一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素C-14羥化酶突變體的重組表達質粒的基因編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突變為纈氨酸。

4.一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是由柔紅霉素C-14羥化酶突變體的重組表達質粒轉化入宿主細胞而獲得。

5.根據權利要求4所述的一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體的基因工程菌，其特征在于，所述柔紅霉素C-14羥化酶突變體的基因工程菌的宿主細胞是大腸桿菌。

6.根據權利要求1所述的一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體，其特征在于，將所述柔紅霉素C-14羥化酶突變體的DNA序列克隆入宿主細胞，并將該宿主細胞的發酵菌體用于阿霉素的生產。

7.根據權利要求1、2、3、4、5或6任一所述的一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體，其特征在于，所述柔紅霉素C-14羥化酶突變體、其基因工程菌、其重組表達質粒及其編碼基因均可以應用在阿霉素、表阿霉素生產中。

8.一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體基因工程菌的生產方法，包括以下步驟：

Q1：菌鏈霉菌C5的C-14羥化酶基因的基因克隆方法，包括以下分步驟：

Q11：PCR擴增：

Q111：設計一對引物：

5’-CTGGATCCATGGGCGGTGGGCGGTCC-3’和

5’-ATAAGCTTCACGGGGCCGGCTTCTCG-3’;

Q112：以鏈霉菌C5菌體為模板，設計PCR擴增引物，進行PCR擴增,PCR體系為：2μl PCR buffer，25mMol/L的MgCl₂1μl,2.5m Mol/L的dNTP1.5μl，取1μl上述Q111步驟中的兩條引物，牙簽挑取少量鏈霉菌C5菌體做為模板，2個單位的Taq酶，二甲基亞砜1μl，最后用無菌水補足至20μl；

Q113：在94℃環境中變性10min后，保持94℃環境中變性30s，然后在72℃環境中退火30s，保持72℃環境中延伸2min；

Q114：上述Q13步驟共進行30次循環，隨后在72℃環境中充分延伸10min；

Q12：含doxA基因的大腸桿菌質粒構建：

Q121：，先在1%的瓊脂糖凝膠中對Q1步驟PCR擴增結束后的物質進行使用電壓為100伏的核苷酸電泳；

Q122：割膠后，用膠回收試劑盒回收1400bp左右的DNA片段，將所獲得的DNA片段和載體pTrc99A用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切；

Q123：酶切產物再次進行電壓為100伏的核苷酸電泳，回收相應大小分別為900bp、4100bp左右的基因片段和載體，最后將載體和片段按1:3的比例混合后，加入1個單位的T4連接酶，16℃連接10小時以上；

Q2：對doxA基因的隨機突變

Q21：取引物對：

5’-AGCCTGAATCACTTCCGAATTCA-3’和

5’-TTCATTGGACCTAATACCGATCA-3’；

Q22：取易錯PCR反應體系50μl，包含物質為：20ng的Q1步驟完成后的含doxA基因的大腸桿菌質粒，各30pmol的Q21步驟中的一對引物，7mMol/LMgCl₂，50mMol/L KCl，10mMol/L Tris-HCl，0.2mMol/L dGTP,0.2mMol/LdATP，1mMol/L dCTP，1mMol/L dTTP,0.05mMol/L MnC1₂，和5個酶活力單位的Taq酶；

Q23：設置PCR反應條件為：在94℃環境下變性10min后，再保持94℃變性30s，然后于72℃環境下退火30s，保持72℃環境中進行延伸2min；

Q24：將Q23步驟重復進行30次循環，然后在72℃環境下充分延伸10min；

Q25：使用1%的瓊脂糖凝膠，進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠后，用膠回收試劑盒回收1400bp左右的DNA目的片段；

Q26：以Q25步驟中回收純化后的DNA片段作為引物，Q1步驟完成后的含doxA基因的大腸桿菌質粒，作為模版，進行PCR擴增，具體如下：

Q261:取反應體系物質配比為：20ng的DNA模板，此模板為Q1步驟完成后的重組大腸桿菌質粒；引物10μl，引物為Q25步驟中回收純化后的DNA片段；2.5mM dNTP8μl，和2個酶活力單位的KOD聚合酶；

Q262：設置PCR反應條件為：在95℃環境中變性8min后，在保持95℃環境中變性45s,然后在58℃環境中退火45s,隨后在68℃環境中延伸5.5min；

Q263：Q262步驟共重復進行25次循環，最后在保持68℃環境中充分延伸10min；

Q264：最終的PCR產物用DpnⅠ酶于37℃環境中，消化1小時后，經65℃環境中10min處理使DpnⅠ酶失活，即得到超過6×103個克隆的突變體庫；

Q3：突變體庫的篩選：

Q31：突變體轉化：通過電擊方法將步驟Q2完成后構建得到的突變體轉化到感受態細胞E.coli DH10B中；

Q32：將完成Q31步驟轉化后的感受態細胞E.coli DH10B細胞涂布于含氨芐抗生素的LB平板上，于37℃環境中進行培養；所述LB平板上另外還含有蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉1%、瓊脂2%；

Q33：突變體篩選與鑒定：

Q331：挑取LB平板上長出的菌體轉接于液體LB試管中，于37℃培養環境中，置于220轉/分鐘的搖床中過夜培養，第二天轉接于裝量50ml LB培養基的250ml搖瓶中，3小時后對菌體進行1mMIPTG誘導，繼續培養18h后，4000轉/分鐘的速率離心15分鐘后，收集菌體；

Q332：對收集的菌體進行柔紅霉素的轉化：2ml的0.1M磷酸緩沖液中溶解0.2g柔紅霉素，加入等量的上述菌體，37℃水浴中、以200轉/分鐘的速率進行震蕩，持續30分鐘之后，測定鹽酸表阿霉素的增加量；

Q34：從完成上述所有步驟的突變體基因工程菌庫中，篩選獲得酶活力得到提高的突變體基因工程菌。