[發(fā)明專利]電轉(zhuǎn)染的方法及設備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310086625.X
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN103146750A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設計）人: 莫邦輝;馬雨;王永生;魏于全
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/86;C12M1/42
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞账?普通合伙) 51124
• 代理人: 劉世平

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因的方法和設備，特別適合但不僅限于對原代淋巴細胞轉(zhuǎn)基因中的電轉(zhuǎn)染的方法及設備。

背景技術(shù)

腫瘤免疫治療領域中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)設計靶向腫瘤細胞的效應T淋巴細胞是很有前景的免疫治療新方法。同種異體骨髓的干細胞移植成功和向高度惡性血液癌癥患者輸注淋巴細胞的臨床案例表明，人體免疫系統(tǒng)可以控制甚至消滅殘余病灶。輸入外源淋巴細胞的主要并發(fā)癥是移植物抗宿主反應，除了攻擊腫瘤細胞也要攻擊正常細胞。由于自體免疫系統(tǒng)的耐受機制，自體淋巴細胞不包含高親和力效應細胞，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使自體淋巴細胞具有靶向腫瘤抗原并殺傷腫瘤細胞成為腫瘤免疫治療的新方向。

篩選和克隆出針對腫瘤抗原的特異性T細胞受體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)把該T細胞受體轉(zhuǎn)入患者外周血T淋巴細胞，然后擴增和激活，回輸患者體內(nèi)，具有靶向性的T淋巴細胞就能殺傷腫瘤細胞，同時又不會殺傷正常組織細胞。尤其對發(fā)生轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化療藥物抵制的腫瘤干細胞采用過繼性T淋巴細胞治療能取得好的效果，這彌補了手術(shù)和化療手段治療腫瘤干細胞的不足。

到目前為止，腫瘤免疫治療中使用過繼性轉(zhuǎn)基因T細胞，都采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體才能產(chǎn)生有效的穩(wěn)定的治療效果，這也導致一些安全隱患。第一：由于轉(zhuǎn)錄病毒載體存在隨機插入整合的問題，會對患者自體細胞造成不可逆的遺傳操作，有產(chǎn)生癌變的潛在風險；第二：目前嵌合抗原受體T細胞一般是用反轉(zhuǎn)錄或者慢病毒轉(zhuǎn)染的外周血T淋巴細胞，在體外篩選并擴增出穩(wěn)定表達細胞，當治療完成或者出現(xiàn)副作用時如何清除掉這些轉(zhuǎn)基因T細胞成為一個后患問題；第三：病毒載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)在操作上繁瑣，會導致產(chǎn)生質(zhì)量管理與控制的不利因素問題。安全問題成為病毒載體轉(zhuǎn)基因的固有缺陷。

非病毒載體轉(zhuǎn)基因方法中最引人關注的是電轉(zhuǎn)染技術(shù)，根據(jù)clinicaltrials.gov統(tǒng)計顯示，到目前為止共有35個電轉(zhuǎn)染的臨床試驗。電轉(zhuǎn)染DNA疫苗，皮下肌肉注射疫苗并輔以電轉(zhuǎn)染的臨床試驗有19例，其中結(jié)腸癌疫苗1例，前列腺癌疫苗1例，H5N1禽流感病毒DNA疫苗2例，黑色素瘤DNA疫苗2例，HIV疫苗5例，乳頭瘤病毒DNA疫苗2例，宮頸上皮內(nèi)瘤DNA疫苗1例，慢性丙型肝炎疫苗2例，血液惡性腫瘤疫苗1例，抗惡性瘧原蟲DNA疫苗1例，晚期癌癥腫瘤疫苗1例。

電轉(zhuǎn)染細胞因子質(zhì)粒，在瘤內(nèi)注射細胞因子質(zhì)粒并輔以電轉(zhuǎn)染的臨床試驗有3例，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤內(nèi)注射并電轉(zhuǎn)IL2質(zhì)粒2例，惡性黑色素瘤內(nèi)注射并電轉(zhuǎn)IL12質(zhì)粒1例。

電轉(zhuǎn)染化療藥物，對頑固性、皮膚鱗狀、膠質(zhì)狀腫瘤注射博萊霉素并輔以電轉(zhuǎn)染的臨床試驗有9例，其中頭頸癌注射電轉(zhuǎn)博萊霉素2例，皮膚及皮下腫瘤注射電轉(zhuǎn)博萊霉素1例，胰腺癌電轉(zhuǎn)博萊霉素1例，黑色素瘤電轉(zhuǎn)博萊霉素1例，直腸癌電轉(zhuǎn)博萊霉素1例，腦轉(zhuǎn)移腫瘤電轉(zhuǎn)博萊霉素1例，電轉(zhuǎn)博萊霉素治療腫瘤皮膚潰瘍轉(zhuǎn)移1例，電轉(zhuǎn)博萊霉素治療復發(fā)乳腺癌1例。

電轉(zhuǎn)染的其它臨床試驗包括電轉(zhuǎn)染安全與耐受性測試2例，不可逆電穿孔治療早期原發(fā)性肝癌1例。

以上統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示電轉(zhuǎn)染技術(shù)還沒有用于原代淋巴細胞的轉(zhuǎn)基因治療，原因是以下四點：

首先，現(xiàn)有的電轉(zhuǎn)染技術(shù)采用電容單次放電形成高壓電場。如圖1所示現(xiàn)有電轉(zhuǎn)染儀的電路原理示意圖，電路包含一個充電回路和一個放電回路。當開關K1導通時，控制電路向電容C充電，待電容充電完成后，斷開開關K1。放電時，使K2導通時，電容C向負載放電。整個電路的放電時間是由放電時間RC的值決定，R是放電回路的等效電阻，包括負載電路的電阻，C是電容的容量值，該電路只能產(chǎn)生單次、正向的高壓放電脈沖，不能產(chǎn)生低壓的放電脈沖。在電容放電中，如果電壓低了，不能在細胞膜上有效的形成小孔，如果電壓高了，能量過于集中，會在細胞膜上形成永久性穿孔，導致靶細胞死亡。由此表明了電容單次放電容易導致原代淋巴細胞凋亡率升高，進而成功轉(zhuǎn)基因的原代淋巴細胞可得率降低。

其次，現(xiàn)有的電轉(zhuǎn)染技術(shù)采用正向脈沖放電，由于細胞內(nèi)是負電荷，因此正電極附近的細胞轉(zhuǎn)染效率比負電極附近的細胞轉(zhuǎn)染效率高，而且細胞膜穿孔都是面向正電極方向，電轉(zhuǎn)染細胞總數(shù)降低和膜穿孔偏少導致轉(zhuǎn)基因原代淋巴細胞可得率降低。

再次，緊接著高壓脈沖放電之后，長時間的低電壓電泳對提高原代淋巴細胞的電轉(zhuǎn)染效率是必要的，但目前沒有這項措施。因為在短暫的高壓電場中，細胞膜會形成暫時性小孔，這時施加低電壓電流，外源分子被電泳進入細胞質(zhì)中。