[發明專利]香豆素衍生物及其制備方法以及彈性蛋白酶活性檢測方法和檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310086356.7
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN104031014A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 楊光富;楊文超;李俊;孫琦;張春芳
• 申請（專利權）人: 華中師范大學
• 主分類號: C07D311/18
• 分類號: C07D311/18;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 王鳳桐;周建秋

技術領域

本發明涉及一種香豆素衍生物及其制備方法和在檢測彈性蛋白酶的活性中的應用。

背景技術

現有技術測定彈性蛋白酶（EC號:3.4.21.37）活性的方法主要有三種。第一種是傳統的高效液相色譜法（HPLC），該方法可以直接用于檢測中性粒細胞彈性蛋白酶介導的水解纖維蛋白原反應。但是，高效液相色譜法實驗過程繁瑣、周期長、并且很難做到彈性蛋白酶抑制劑或促進劑的高通量篩選。第二種是紫外吸收光譜法，該方法操作簡單、反應快速，目前已獲得廣泛的使用，但是這種方法存在以下兩方面的缺陷：首先，紫外吸收光譜法的背景干擾大導致分析的靈敏度低。其次，用于分析的底物均為多肽衍生物或蛋白質，底物的制備成本高。目前普遍應用的第三種彈性蛋白酶活性的檢測方法是熒光發射光譜法，該方法以多肽類為熒光探針，檢測的靈敏度高、操作方法簡單、并且可以用于高通量篩選。該方法的缺陷在于多肽類探針在常規條件下大都穩定性差，儲存和運輸條件苛刻，原子利用率低。

目前國內外還沒有非肽熒光探針用于檢測彈性蛋白酶活性及其抑制劑或促進劑篩選的報道。因此，設計開發基于非肽熒光探針的靈敏、性質穩定、操作簡便、成本低廉的檢測方法是非常迫切和必要的。

發明內容

本發明的目的在于克服現有彈性蛋白酶活性檢測技術中存在的缺陷，提供一種靈敏度高、性質穩定、操作簡便、易于儲運并且成本低廉的非肽彈性蛋白酶活性檢測熒光探針和彈性蛋白酶活性檢測方法。

為達到上述目的，本發明提供一種香豆素衍生物，該香豆素衍生物具有式（1）所示結構，其中，R₁為五氟乙基和七氟丙基中的一種，R₂為三氟甲基、甲基、氰基、吡啶環和苯并噻唑環中的一種；

式（1）。

本發明提供了上述香豆素衍生物的制備方法，該方法包括在親核反應條件和縛酸劑存在下，在有機溶劑中，將式（2）所示結構化合物與酰氯或酸酐中的一種接觸；

式（2）

其中，所述酰氯選自五氟丙酰氯、七氟丁酰氯中的一種，所述酸酐選自五氟丙酸酐、七氟丁酸酐中的一種。

本發明提供上述香豆素衍生物在檢測彈性蛋白酶的活性中的應用。

本發明提供了一種彈性蛋白酶的活性的檢測方法，該方法包括：將含有彈性蛋白酶的待測樣品與本發明所述的香豆素衍生物接觸，得到接觸后的物料；檢測接觸后的物料在激發光下發出的熒光強度的增加值，所述熒光強度的增加值指示了待測樣品中彈性蛋白酶的活性；所述激發光的波長為340-430nm，所述熒光的發射波長為450-520nm。

本發明同時提供一種彈性蛋白酶的活性的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括：本發明所述的香豆素衍生物、彈性蛋白酶標準品以及反應緩沖液。

本發明的香豆素衍生物在用于檢測彈性蛋白酶活性時，與彈性蛋白酶具有更高的親和力，檢測的有效性更高。

本發明提供的香豆素衍生物熒光探針，在用于篩選彈性蛋白酶抑制劑時，與采用多肽類熒光探針相比，具有更高的靈敏度；并且本發明的有機小分子熒光探針，不會與抑制劑發生相互作用，避免了副反應發生對檢測準確性的干擾，有利于彈性蛋白酶抑制劑或促進劑的發現。

因此，本發明提供的香豆素衍生物熒光探針用于與彈性蛋白酶活性檢測有關的應用時的靈敏度高、與酶的親和力高、熒光強度的變化范圍廣易于探查，原子利用率高，并且本發明的香豆素衍生物為非肽類的熒光探針，非肽類熒光探針相比于肽類熒光探針穩定性更高、使用更方便、價格更低廉。

本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：

圖1彈性蛋白酶催化熒光探針水解反應的示意圖，其中hv表示：光子能量。

圖2各種酶或蛋白質催化10μM熒光探針水解的相對速率。

具體實施方式

以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。

本發明提供了一種香豆素衍生物，該香豆素衍生物具有式（1）所示結構，其中，R₁為五氟乙基和七氟丙基中的一種，R₂為三氟甲基、甲基、氰基、吡啶環和苯并噻唑環中的一種；

式（1）。