[發明專利]一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養基及其培養方法和其應用

無效

• 申請號: 201310086236.7
• 申請日: 2013-03-19
• 公開（公告）號: CN103160555A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 熊媛媛;蔣玉文;漆世華;黃濤;鄭佳;朱薇;謝紅玲;溫文生
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K14/33;A61K39/08;A61K38/16;A61P31/04;A61P1/00;A61P1/12;C12R1/145
• 代理公司: 北京慶峰財智知識產權代理事務所(普通合伙) 11417
• 代理人: 劉元霞

1.一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養基，所述培養基由下述重量份的成分組成：牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaCl3-6重量份，加水至1000重量份，優選所述培養基由下述重量份的成分組成：牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaCl5重量份，加水至1000重量份。

2.根據權利要求1所述的培養基，所述培養基的pH值為7.0-8.5，優選pH值為7.5-8.0。

3.根據權利要求1-2任一項所述的培養基，所述的產氣莢膜梭菌選自A型產氣莢膜梭菌、B型產氣莢膜梭菌、C型產氣莢膜梭菌、D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優選為C型產氣莢膜梭菌。

4.一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養方法，包括下述步驟：

1）一級種子的培養：將產氣莢膜梭菌接種于血平板，在33-37℃下培養16-24h，制得產氣莢膜梭菌的一級種子；

2）二級種子的培養：從產氣莢膜梭菌的一級種子培養物中挑取有雙層溶血環的單菌落，將其接種于培養基中，在33-37℃下培養16-18h，制得產氣莢膜梭菌的二級種子；

3）發酵培養：按照70%（v/v）在發酵罐中加入培養基，以培養基體積計，加入0.1%（v/v）的消泡劑，高壓滅菌，將培養基降至35℃±3℃，再按1%-3%（v/v）的接種量接種產氣莢膜梭菌的二級種子，在33-37℃下和pH6.5-8.0下培養5-7h，制得產氣莢膜梭菌的發酵培養物，優選在116℃高壓蒸汽滅菌30min；

其中，所述培養基由下述重量份的成分組成：牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaCl3-6重量份，加水至1000重量份，優選所述培養基由下述重量份的成分組成：牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaCl5重量份，加水至1000重量份。

5.根據權利要求4所述的培養方法，所述產氣莢膜梭菌的培養方法選自厭氧培養、靜置培養、靜置厭氧培養的任一種或其組合。

6.根據權利要求4-5任一項所述的培養方法，發酵培養中采用氨水調節其pH值，優選pH值為7.0-7.4。

7.根據權利要求4-6任一項所述的培養方法，所述培養基的pH值為7.0-8.5，優選pH值為7.5-8.0。

8.根據權利要求4-7任一項所述的培養方法，發酵培養溫度為35-36℃。

9.根據權利要求4-8任一項所述的培養方法，所述的產氣莢膜梭菌選自A型產氣莢膜梭菌、B型產氣莢膜梭菌、C型產氣莢膜梭菌、D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優選為C型產氣莢膜梭菌。

10.一種產氣莢膜梭菌外毒素提取物，由下述方法制備得到：將權利要求4-9任一項制得的產氣莢膜梭菌的發酵培養物在4℃條件下14800g離心，取上清，即得。

11.一種產氣莢膜梭菌外毒素提取物的制備方法，包括下述步驟：將將權利要求4-9任一項制得的產氣莢膜梭菌的發酵培養物在4℃條件下14800g離心，取上清，即得。

12.權利要求4-11任一項制得的產氣莢膜梭菌外毒素或其提取物用于預防由產氣莢膜梭菌引起的相關疾病的藥物或疫苗中的應用，優選所述產氣莢膜梭菌外毒素或其提取物經滅活脫毒制成的類毒素用于預防由產氣莢膜梭菌引起的相關疾病的藥物或疫苗中的應用，所述的相關疾病選自仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥、人氣性壞疽、食物中毒的任一種或其組合。

13.一種外毒素提取物的滅活脫毒方法，包括下述步驟：在37℃條件下，在權利要求10所述的外毒素提取物中加入甲醛，混合均勻，使其終濃度為0.4%-0.5%，放置，即得，優選放置3-8日，更優選放置3-5日。

14.一種產氣莢膜梭菌類毒素疫苗，所述的疫苗由類毒素液與20%氫氧化鋁膠按體積比為5:1均勻混合而成。