[發(fā)明專利]使用了酶的測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310084573.2
• 申請(qǐng)日: 2013-03-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103305588A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杉山幸司;米原聰;下地一彥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社;龜甲萬(wàn)百歐凱米發(fā)株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12Q1/37
• 分類號(hào): C12Q1/37;C12Q1/28;C12Q1/26
• 代理公司: 北京東方億思知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11258
• 代理人: 柳春雷

技術(shù)領(lǐng)域

本公開(kāi)涉及使用了酶的測(cè)定方法、以及其中使用的試劑盒。

背景技術(shù)

存在很多使用酶對(duì)測(cè)定對(duì)象物進(jìn)行測(cè)定的方法。作為第1類型，有具有特異性的酶直接作用于測(cè)定對(duì)象物來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的方法。作為第1類型的例子，已知有測(cè)定對(duì)象物為葡萄糖，酶使用葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶的方法，或者測(cè)定對(duì)象物為尿酸，酶使用尿酸酶的方法。另外，作為第2類型，存在使用作用于測(cè)定對(duì)象物的酶生成源自測(cè)定對(duì)象物的生成物之后，使具有特異性的酶作用于該生成物的情況。作為第2類型的例子，已知有：測(cè)定對(duì)象物為糖化蛋白質(zhì)，使用蛋白酶作為作用于測(cè)定對(duì)象物的酶，使用FAOD作為具有特異性的酶的方法；測(cè)定對(duì)象物為膽固醇，使用膽固醇酯酶作為作用于測(cè)定對(duì)象物的酶，使用膽固醇氧化酶作為具有特異性的酶的方法；測(cè)定對(duì)象物為肌酐，使用肌酐酶作為作用于測(cè)定對(duì)象物的酶，使用肌氨酸氧化酶作為具有特異性的酶的方法等。

在第2類型的方法中，具有特異性的酶和作用于測(cè)定對(duì)象物的酶的添加順序有：在作用于測(cè)定對(duì)象物的酶之后添加具有特異性的酶的情況、在作用于測(cè)定對(duì)象物的酶之前添加具有特異性的酶的情況、同時(shí)添加作用于測(cè)定對(duì)象物的酶和具有特異性的酶的情況。

在作用于測(cè)定對(duì)象物的酶之后添加具有特異性的酶的情況下，由于預(yù)先由測(cè)定對(duì)象物已生成與具有特異性的酶反應(yīng)的物質(zhì)，因此存在具有特異性的酶的反應(yīng)迅速進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)。

在作用于測(cè)定對(duì)象物的酶之前添加具有特異性的酶的情況下，存在能夠去除成為損害測(cè)定精度的原因的物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。即，當(dāng)作用于測(cè)定對(duì)象物的酶所生成的源自測(cè)定對(duì)象物的生成物已經(jīng)在試樣中作為內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí)，該內(nèi)源性物質(zhì)會(huì)損害測(cè)定精度。通過(guò)先添加具有特異性的酶，能夠預(yù)先消除該內(nèi)源性物質(zhì)。

在同時(shí)添加作用于測(cè)定對(duì)象物的酶和具有特異性的酶的情況下，存在能夠作為一個(gè)試劑的優(yōu)點(diǎn)。

已知有一種使用了酶的糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定方法，該方法使蛋白酶與糖化蛋白質(zhì)作用，生成糖化氨基酸或糖化肽，并測(cè)定使FAOD與這些糖化氨基酸或糖化肽作用而生成的過(guò)氧化氫。

FAOD根據(jù)底物特異性而存在若干種，但是任何一種均只與糖化氨基酸或短的糖化肽反應(yīng)，例如WO2008-108385和WO2004-038034中公開(kāi)了與由6個(gè)氨基酸構(gòu)成的糖化肽反應(yīng)。但是，尚不知曉直接與由超過(guò)6個(gè)的氨基酸構(gòu)成的糖化肽或糖化蛋白質(zhì)反應(yīng)的FAOD。

因此，為了使用FAOD測(cè)定糖化蛋白質(zhì)，需要將糖化蛋白質(zhì)分解成糖化氨基酸或由6個(gè)以下的氨基酸構(gòu)成的糖化肽。作為分解方法，雖也存在使用了酸或堿的化學(xué)方法，但從其花費(fèi)的功夫或簡(jiǎn)便性方面考慮，以蛋白酶和糖化蛋白質(zhì)變性劑的組合使用的方法最為有效。通過(guò)該方法，例如能夠由糖化蛋白質(zhì)生成可在5分鐘左右測(cè)定的程度的糖化氨基酸、糖化肽。

蛋白質(zhì)的糖化通過(guò)在N末端的氨基或中途的賴氨酸、精氨酸的側(cè)鏈的氨基上結(jié)合葡萄糖等的糖而引起，因此在蛋白質(zhì)的分子內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)引起糖化。因此糖化蛋白質(zhì)中，存在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的N術(shù)端的氨基或中途的賴氨酸或精氨酸的氨基的某個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)被糖化的糖化蛋白質(zhì)，存在非常多的種類。

在僅血紅蛋白的β鏈N末端糖化了的HbA1c中僅特異性測(cè)定該糖化位點(diǎn)、即僅特異性測(cè)定β鏈N末端的糖化位點(diǎn)的方法以得到了實(shí)際應(yīng)用。另一方面，一般進(jìn)行著測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的多個(gè)糖化位點(diǎn)中的一部分的糖化位點(diǎn)的方法。這是因?yàn)閮H測(cè)定蛋白質(zhì)的中途的賴氨酸或精氨酸的特定一個(gè)位點(diǎn)的糖化并不實(shí)用。作為其原因，可以舉出：必須使蛋白酶特異性作用從而僅由特定位點(diǎn)生成糖化氨基酸或糖化肽、以及存在各個(gè)位點(diǎn)的糖化的速度根據(jù)蛋白質(zhì)的狀態(tài)而變動(dòng)的可能性。

已知葡萄糖等糖和氨基酸共存時(shí)，容易生成糖化氨基酸。為了延長(zhǎng)蛋白質(zhì)對(duì)糖化蛋白質(zhì)的作用時(shí)間，最先添加蛋白酶是理想的。但是，另一方面，由于試樣中可能含有糖化氨基酸，因此為了正確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的量，先添加果糖氨基酸氧化酶(FAOD)來(lái)消除糖化氨基酸是理想的。為了在FAOD之后添加蛋白酶，并使用一個(gè)蛋白酶而生成源自糖化蛋白質(zhì)的全部糖化位點(diǎn)的糖化氨基酸或糖化肽，需要提高蛋白酶濃度，或者使用特異性低的蛋白酶，或者使之長(zhǎng)時(shí)間作用。