[發(fā)明專利]鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法

無(wú)效

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• 申請(qǐng)日: 2013-03-18
• 公開（公告）號(hào): CN103214575A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶國(guó)興;王俊麗;明紅;王貝;劉起麗;段艷艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 新鄉(xiāng)市平原專利有限責(zé)任公司 41107
• 代理人: 于兆惠

技術(shù)領(lǐng)域??

本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法。

背景技術(shù)

鯉魚（Cyprinus?carpio），又稱鯉拐子、鯉子，隸屬于魚綱，鯉形目，鯉科。其種類多，有紅鯉、團(tuán)鯉、草鯉、荷色鯉、錦鯉、火鯉、芙蓉鯉、荷包鯉等。鯉魚對(duì)水體環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖傳統(tǒng)的優(yōu)良品種。

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體rBAT/b⁰+AT是一種異源二聚體，包含rBAT和b⁰+AT兩個(gè)亞基，是腎臟和小腸頂膜轉(zhuǎn)運(yùn)堿性氨基酸的主要載體蛋白。rBAT為轉(zhuǎn)運(yùn)亞基，b⁰+AT是催化亞基。rBAT蛋白是一個(gè)II型膜糖蛋白，具有與細(xì)菌糖苷酶同源的大胞外環(huán)結(jié)構(gòu)域，并且高度糖基化。

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體不僅介導(dǎo)氨基酸從胞外轉(zhuǎn)入胞內(nèi)發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)作用，同時(shí)也介導(dǎo)氨基酸作為神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞內(nèi)外，完成神經(jīng)細(xì)胞抑制或興奮等重要功能。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)吸收異常會(huì)導(dǎo)致范科尼綜合癥、胱氨酸尿癥、家族性腎原性亞甘氨酸尿癥、肥胖和哈氏遺傳性疾病等氨基酸代謝障礙性疾病。因此，研究氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體分子特性及功能等方面對(duì)于機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝及疾病病理的研究具有重要意義。

為了研究rBAT基因表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性的調(diào)控因素及調(diào)控機(jī)理，需要高特異性的rBAT抗體。rBAT抗體可為rBAT的組織定位、細(xì)胞定位、表達(dá)定量、魚類氨基酸代謝障礙等系列研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。獲得大量有活性的rBAT蛋白作為免疫抗原是制備高活性抗體的關(guān)鍵。由于鯉魚rBAT蛋白是典型的跨膜蛋白，組織含量低，具有1個(gè)跨膜域，因此，不能有效地分離純化及體外表達(dá)超量具有生物活性的rBAT抗原蛋白成了制備rBAT抗體的瓶頸。

與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)一的技術(shù)方案是通過(guò)蛋白質(zhì)分離純化的方法，從組織中直接分離純化rBAT蛋白作免疫抗原。其缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)蛋白一般含量很低，提取方法復(fù)雜，得到的蛋白量相對(duì)較少，含雜質(zhì)多，需要復(fù)雜的純化過(guò)程，成本高。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)二的技術(shù)方案是通過(guò)構(gòu)建工程菌體外表達(dá)外源蛋白作免疫抗原。其缺點(diǎn)是通過(guò)構(gòu)建原核或真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)抗原蛋白，雖然體外表達(dá)的效率和表達(dá)量比較高，但是這種方法有很多的局限性，很多特殊結(jié)構(gòu)異源基因如富含AT堿基和一些跨膜蛋白的基因很難在微生物中表達(dá)或者表達(dá)量很低，有的即使表達(dá)了但是沒(méi)有活性。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)三的技術(shù)方案是通過(guò)無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白，無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是指以細(xì)胞裂解液為基礎(chǔ)，加之外援的RNA模板、氨基酸和能量所構(gòu)成的細(xì)胞外表達(dá)體系。其缺點(diǎn)是無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)一些跨膜蛋白，但是這項(xiàng)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外還處于實(shí)驗(yàn)室研究水平，技術(shù)難度大，成本高，目前還無(wú)法實(shí)際應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)外已經(jīng)完成了對(duì)鯉魚rBAT全長(zhǎng)的測(cè)序工作，包括5′端非翻譯區(qū)（5′UTR），3′端非翻譯區(qū)（3′UTR），一個(gè)2000bp左右的開放閱讀框（ORF）。經(jīng)序列同源性分析顯示，rBAT氨基酸序列具有高度保守性，鯉魚rBAT氨基酸序列和斑馬魚的相似性最高達(dá)80%以上，與豬的rBAT氨基酸序列相似性最低（低于60%）。鯉魚腸道rBAT基因全長(zhǎng)2040?bp，其rBAT蛋白含有跨膜域，所以重組表達(dá)rBAT基因全長(zhǎng)存在一定的困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟：（1）克隆鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的基因，通過(guò)分析膜蛋白rBAT的三維結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和抗原決定簇，利用原核表達(dá)具有抗原決定簇的部分rBAT基因片段作為免疫抗原蛋白代替表達(dá)全長(zhǎng)基因；（2）構(gòu)建氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的基因工程菌；（3）氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定；（4）制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT抗原；（5）免疫兔子；（6）采血樣測(cè)定鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的效價(jià)；（7）頸動(dòng)脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的兔抗血清；（8）免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。