[發(fā)明專利]鯉魚氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT兔抗血清的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310084522.X
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN103214575A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設計）人: 聶國興;王俊麗;明紅;王貝;劉起麗;段艷艷
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 新鄉(xiāng)市平原專利有限責任公司 41107
• 代理人: 于兆惠

1.鯉魚氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟：（1）克隆鯉魚腸道氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT的基因，通過分析膜蛋白rBAT的三維結構、跨膜區(qū)和抗原決定簇，利用原核表達具有抗原決定簇的部分rBAT基因片段作為免疫抗原蛋白代替表達全長基因；（2）構建氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT的基因工程菌；（3）氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT基因工程菌的誘導表達與鑒定；（4）制備氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT抗原；（5）免疫兔子；（6）采血樣測定鯉魚腸道氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT的效價；（7）頸動脈采血制備氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT的兔抗血清；（8）免疫組織化學方法檢測。

2.根據(jù)權利要求1所述的鯉魚氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟（4）中制備氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT抗原的具體步驟為：將步驟（3）誘導表達的菌液離心，棄上清，按照濕重1?g的菌體加6?ml的蒸餾水，吹打混勻，再加入與上述菌體混合液等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴10?min，使蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將分離膠放于0.3?M?KCl溶液里染色，顯示目的條帶，切下膠上的目的蛋白條帶，放入ddH₂O里清洗，將膠條剪碎放入塑料培養(yǎng)皿中，冷凍干燥1?d，放入研缽中磨成粉末，每200?mg目的蛋白粉加3?ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計檢測蛋白濃度。

3.?根據(jù)權利要求1所述的鯉魚氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟（5）中免疫兔子的具體步驟為：按注射要求將蛋白溶液稀釋；乳化：耳緣靜脈注射：0.8?ml蛋白溶液+0.4?ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩，皮內注射：1?ml蛋白溶液+1?ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法：第一、二次采用耳緣靜脈注射法，第三、四次采用皮內多點注射法；每隔10?d加強免疫1次，第1次免疫加完全弗氏佐劑，以后加強免疫時用不完全弗氏佐劑。

4.?根據(jù)權利要求1所述的鯉魚氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟（7）中頸動脈采血制備氨基酸轉運載體轉運亞基rBAT的兔抗血清的具體步驟為：步驟（5）中第四次免疫后8?d頸動脈采血，兔子在采血前禁食1?d，采集血樣收集于經(jīng)滅菌并不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2?h，待血液凝塊后，4?℃保存使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉移至另一管中，血凝塊以1500?rpm離心10?min，吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分裝冷凍干燥保存，部分放于4?℃?zhèn)溆谩?/p>