[發明專利]一種填充床反應器制備血管緊張素轉化酶抑制肽的方法

無效

• 申請號: 201310083994.3
• 申請日: 2013-03-15
• 公開（公告）號: CN103215330A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 郭宇星
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34;C12R1/225
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及一種填充床反應器制備血管緊張素轉化酶抑制肽的方法，屬于功能性乳制品開發技術領域。?

背景技術

血管緊張素轉化酶（angiotensin-converting?enzyme,簡稱ACE）抑制肽作為一類具有抑制ACE活性的肽類物質，通過抑制ACE的活性，阻礙有升高血壓作用的血管緊張素Ⅱ的生成，同時抑制具有降血壓作用的血管舒緩激肽的分解，從而使高血壓下降，達到降血壓的功能。目前已有的治療高血壓的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑有卡托普利、阿拉普利等，這些是化學合成物，吸收排泄速度快，會引起咳嗽，腎臟損傷及血管神經性水腫等副作用，而來源于動物或者植物蛋白的ACE抑制肽，安全可靠。因此，尋找天然的ACE抑制肽則變得非常重要。?

乳清是生產奶酪的副產物，其再開發是近幾年來的研究熱點。乳清蛋白中包含有許多生物活性肽序列，可以通過發酵或者酶解的手段得到。目前有關從乳清蛋白中酶解得到ACE抑制肽的報到中使用的酶都為游離酶，利用游離酶制備ACE抑制肽存在一定的弊端：（1）不能重復利用，難以將產物和酶分離，需要進一步純化；（2）游離酶不易保存，易失活而增加成本等。這一系列弊端使ACE抑制肽的大規模生產存在成本高而不穩定的問題。?

針對以上ACE抑制肽生產中存在的問題，本發明將瑞士乳桿蛋白酶固定化，并且利用了填充床反應器實現乳清ACE抑制肽的連續制備。近年來研究發現瑞士乳桿菌制作的發酵乳具有較強的降血壓功能，主要是因為瑞士乳桿菌蛋白酶能水解蛋白產生多肽，即血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽。瑞士乳桿菌蛋白酶固定化后可以重復利用，將其作為填充床反應器的填充載體可以實現ACE抑制肽的規模制備。填充床反應器，又稱固定床反應器，就是將固定化酶填充于反應器內，制成穩定的柱床，然后以一定的流速通入水解底物，在一定的反應條件下實現酶催化反應，收集水解產物。填充床反應器具有如下優點：高效率、易操作、結構簡單等，它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液。?

迄今為止，國內外雖然有很多關于ACE抑制肽的機制研究和分離方法研究，但是連續大規模制備ACE抑制肽的研究還是較少見的，本發明使用填充床反應器可以實現ACE抑制肽?的連續化制備，對乳源ACE抑制肽的生產開發具有一定的經濟價值和現實意義。?

發明內容

本發明的目的：本發明的目的是提供一種填充床反應器制備血管緊張素轉化酶抑制肽的方法。?

一種填充床反應器制備血管緊張素轉化酶抑制肽的方法是，將海藻酸鈉與瑞士乳桿菌蛋白酶酶液混勻，用注射器滴入氯化鈣溶液中，固化洗滌瀝干，即得到固定化蛋白酶；以固定化瑞士乳桿菌蛋白酶為填充床反應器的填充載體，進行乳源ACE抑制肽的制備；水解液經中空纖維膜超濾，冷凍干燥后制成ACE抑制肽產品。?

本發明的具體步驟如下：?

（1）海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶?

將瑞士乳桿菌用液體MRS培養基37℃培養16-24h。4℃，4500r/min，離心20min，收集瑞士乳桿菌菌體，并洗滌三次。取瑞士乳桿菌菌體，用pH7.8Tris-HCl緩沖液重新懸浮，菌體與緩沖液比例為1g：30mL，攪勻后在300W，破碎時間3s，間隔時間5s的超聲波破碎條件下破碎200次。將破碎液于4℃，4500r/min，離心20min，取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液。?

在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液（蛋白含量為8mg/mL）中加入0.6g海藻酸鈉，37℃水浴攪拌混勻。4℃條件下靜置備用。用10mL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入0.1mol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4℃條件下靜置4h，洗滌瀝干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。（2）海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶填充床反應器的制備?

把固定化瑞士乳桿菌蛋白酶和乳清蛋白溶液（質量濃度5g/100mL的WPC-80濃縮乳清粉）充分混合后裝入1.2cm×80cm的填充柱，具體裝置見圖1。固定化瑞士乳桿菌蛋白酶和乳清蛋白溶液先于填充柱中靜置水解8h，然后開啟恒流泵實現連續式水解，流速為3.2mL/h，連續收集2d。?

（3）乳源ACE抑制肽的超濾?

選用截留分子量為6000Da的中空纖維超濾膜進行超濾，料液溫度為37℃，超濾壓力為0.05Mpa，超濾液進行冷凍干燥后即得到ACE抑制肽產品。?

本發明的有益效果:?