[發明專利]一種基于Fe3O4納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法

有效

• 申請號: 201310083584.9
• 申請日: 2013-03-17
• 公開（公告）號: CN103175858A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 張錦勝;唐群;賴衛華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及一種致病菌的快速檢測方法，尤其涉及一種基于Fe₃O₄納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法。

背景技術

基本原理：單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結合。其主要的原理步驟：1.?向待檢樣本中加入目標菌的第1抗體，若存在目標菌，則與1抗結合形成1抗復合物；2.?利用磁性Fe₃O₄納米粒子,?通過修飾抗體實現表面功能化,將1抗的抗體即2抗偶聯在磁珠表面，形成特異性免疫磁珠，并將多余活性位點封閉。2.?將另一部分目標菌的特異性1抗單克隆抗體采用一定的方法固定在固相載體表面，并將多余活性位點封閉。3.?將第2步制備的2抗特異性免疫磁珠加入到第1步的待檢樣本中，用于抓取富集目標菌，通過外加磁場將磁珠分離出來，此時，結合了目標菌的1抗復合物和沒有結合目標菌的過量1抗都會與磁珠表面的2抗結合，還是混在一起。4.?將上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相載體表面，則抓取了目標菌的磁珠將與固相載體表面1抗發生特異性結合，形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗可以將未發生結合的磁珠洗脫。5.?再采用洗脫劑將固定載體上的結合的特異性納米免疫磁珠洗下來，磁分離清洗掉離子、溶劑。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目標菌的磁珠。由于Fe₃O₄納米粒子具有順磁和超順磁特性，對于磁共振儀器非常敏感，相對于其他分子而言，微量的Fe₃O₄納米粒子能夠大幅降低無菌的去離子水的自旋-晶格馳豫參數T1和自旋-自旋弛豫時間T2，而無菌的去離子水在一定的均勻場強下，T1/T2是固定的。將洗脫液置于核磁共振儀中，與無菌的去離子水對照組進行對照。顯著發生T1/T2值降低的說明有磁珠存在，從而間接說明食品樣品中有致病菌檢出。磁珠含量與T1/T2值降低呈正比。通過加標，可以定量檢測目標菌。該方法中Fe₃O₄納米粒子磁珠既是分離富集的手段，同時Fe₃O₄納米粒子具有的順磁和超順磁特性，又可作為定量檢測的探針。該方法的主要優點就是快速、靈敏度高。相對于致病菌的微生物培養2-3天甚至幾天的時間，此方法主要取決于樣品的預處理時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。因此，用該方法可做大規模待檢樣本的陽性篩選，檢出的陽性樣還需用微生物培養進行確證。目前，國內外還沒有文獻報道這種方法，但是采用免疫磁珠進行致病菌的富集、目標物的富集等的報道還是很多的，但都沒有采用核磁共振做進一步的檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于Fe₃O₄納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，用于對各種不同的食品樣品進行評價，該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時間。

一種基于Fe₃O₄納米粒子間接富集的核磁共振技術快速檢測出食品中的有害致病菌的方法。利用核磁共振儀對順磁、超順磁物質的響應敏感性，提出核磁共振弛豫參數變化與Fe₃O₄納米粒子超順磁免疫磁珠含量的相關性指標。不同的致病菌檢出下限不同。

該方法依賴于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分離，從核磁共振弛豫信號參數變化的角度，檢測出樣品中的有害致病菌；采用目標菌的1抗標記形成1抗復合物；采用偶聯1抗抗體即2抗的超順磁免疫磁珠，可以將樣品中的特異性致病菌進行富集并分離；由于核磁共振儀自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率對Fe₃O₄納米粒子非常敏感，即在去離子水中，存在微量的超順磁Fe₃O₄納米粒子，則水的自旋-晶格弛豫時間（T1）和/自旋-自旋弛豫（T2）就會顯著下降。在一定條件下，超順磁免疫磁珠的順磁特性使核磁共振的弛豫衰減信號T2/T1產生線性減小。通過定量檢測出樣品中的免疫磁珠含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測出的致病菌含量與磁珠含量線性相關，擬合度較好。最終以超順磁免疫磁珠與致病菌間的對應關系為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數。

本發明是這樣實現的，步驟如下：